解放军文职招聘考试核酸原位杂交的基本操作步骤

  核酸原位杂交的基本操作步骤

一、组织切片预处理

1、石蜡切片，捞片于涂有1mg/ml多聚赖氨酸或1：50的APES的玻片上，60℃烤箱过夜。

2、常规脱蜡入水。

3、0.01MPBS洗5分钟×3次。

4、0.02NHCL10分钟。

5、0.01MPBS洗5分钟。

6、25ug/ml蛋白酶K消化37℃30分钟。

7、0.01MPBS洗5分钟×3次。

8、85%、95%乙醇，无水乙醇依次脱水。

9、室温干燥。

二、杂交

1、变性：滴加杂交液（25ul/张，地高辛标记的探针）放入50%甲酸胺湿盒内，上加硅化盖玻片；96-98℃，10分钟，原有的DNA双股螺旋结构被解开。

2、约15℃水温中10分钟。

3、置42℃温箱中杂交过夜。

三、洗涤及显色

1、    50%甲酸胺中轻轻揭去盖玻片。

2、    2×SSC 5分钟。

3、    2×SSC 30分钟。

4、    1×SSC 15分钟，37℃。

5、    1×SSC 15分钟，室温。

6、    buffer Ⅰ 5分钟。

7、    buffer Ⅱ 15分钟。

8、    封闭：bufferⅠ500ul ＋ TitonX-100 1.5ul＋NSS(双蒸水)10ul，室温30分钟。

9、    滴加抗体复合物：

bufferⅠ500ul ＋ TitonX-100 1.5ul＋NSS 5ul＋dig－AP1ul(碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体)，37℃2小时。

10、bufferⅠ 5分钟×2次。

11、buffer Ⅲ 3分钟。

12、显色：buffer Ⅲ1000ul＋左旋咪唑0.24mg＋NBT4.5ul＋BCIP3.5ul,1～72小时。

13、buffer Ⅶ 5分钟。

14、双蒸水5分钟。

15、淡复染胞核或胞浆。

16、常规脱水、透明、中性树胶封片、镜检。

结果：阳性部位呈蓝色颗粒沉淀。