解放军文职招聘考试核酸原位杂交的主要过程

 核酸原位杂交的主要过程

核酸原位杂交按检测物的不同，分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。

一．组织细胞的固定

进行核酸原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理。适宜核酸杂交的理想的固定液应具备下列特点：1.能很好地保护组织细胞的形态。2.对核酸无抽提、修饰与降解作用。3.不改变核酸在细胞内的定位。4.对核酸与探针的杂交过程无阻碍作用。5.对杂交信号无遮蔽作用。6.理化性质稳定、价格低廉。

病理组织学常用的固定液均可用与核酸原位杂交是组织和细胞的固定，但各具优缺点。一般而言，4%多聚加全市应用最为广泛的固定液之一，它能很好地保持组织或细胞内的RNA，一般固定10-15分钟RNA的含量比较恒定。10%的甲醛液虽然可促进DNA双链分子的交联进而变性，但用含50%的甲酰胺杂交液进行杂交可解决。乙醇：冰醋酸（3：1）虽然广泛用于核酸原位杂交时的组织细胞固定，不过固定后组织细胞内RNA明显减少，但同时本底也很低。由于固定的时间一是一个影响原位杂交的重要因素，因此还必须根据具体实验摸索出适合自己要求的固定液与固定时间。

二．预杂交

核酸原位杂交时，由于组织细胞中的核酸都与细胞内蛋白质结合，以核酸蛋白质复合体的形式存在与细胞浆或细胞核中，固定过程中固定液的交联作用时胞浆或胞核内的各种生物大分子形成网络，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。因此，需进行预杂交的过程，其目的是去除核酸表面的蛋白质，屹立与核酸探针对靶核酸进行杂交。常用去垢剂（detergeat）和/或蛋白酶对组织细胞进行部分的消化酶解以去除核酸表面的蛋白质。常用的去垢剂由Triton-X100和十二烷基碘酸钠（SDS），常用的蛋白酶有蛋白酶K等。蛋白酶K的纯度、浓度、消化的时间在不同的组织细胞中相差极大，因此，必须进行一系列的预试验，找到适当的浓度及消化时间。

三、杂交

杂交过程是核酸原位杂交技术的主要环节，包括以下重要内容。

1、探针的选择 核酸原位杂交中所用的探针可以是双链的DNA（dsDNA）也可以是单链的DNA（ssDNA）,或为RNA。近年来人工合成的寡核苷酸也得到了广泛应用。一般而言，标记的DNA或RNA探针都可用于DNA或RNA的定位，其长度为50-300bp（碱基）最好，这个长度范围的探针在组织细胞中的穿透力好，杂交效率高。常用的探针有：

（1）双链DNA探针。常用于杂交的探针之一，可通过切口平移标记或随机引物标记法标记。后者与前者相比，能产生高比活的探针，但标记探针的产量较低，不适合大量切片的原位杂交。

（2）人工合成脱氧寡核苷酸。可由DNA合成仪合成，与克隆的DNA相比，人工合成脱氧寡核苷酸有下列优点：特异性较高，当DNA顺序未知时可按氨基酸顺序进行合成，可用于相似基因顺序差异研究；可用合成的不同顺序探针对特定基因进行最佳杂交条件的筛选；由于分子量小，与相同量的dsDNA探针相对而言，具有高得多的摩尔浓度。

（3）单链cDNA探针。单链cDNA探针常通过克隆载体M13获得。ssDNA探针与dsDNA探针相对比，其最大优点在于，ssDNA探针不会像dsDNA探针那样与自身互补的第二条链复性杂交，增加了探针的有效浓度。

（注：M13是大肠杆菌丝状噬菌体系列中的一个。含有6400个左右的核苷酸单链闭环DNA分子。在用作克隆载体时，可以产生大量含有外源性DNA某一条链的DNA分子。）

（4）单链反义RNA探针。可由构建的RNA表达载体而获得。在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板合成反义RNA探针。这种探针与切口平移标记的DNA探针相比，特异性高，RNA/RNA形成的杂交分子具有热稳定性，而且探针的大小也比较恒定，因而增加了杂交的敏感性及均一性。此反义RNA探针不含有载体顺序，减少了非特异性杂交，还能防止dsDNA中第二条链的竞争性杂交。杂交后用RNA酶消化单链未杂交的探针，可明显减少本底。因此，RNA探针在核酸原位杂交中的应用也越来越广泛。

（5）反义寡核苷酸探针。见合成的20-70个寡核苷酸克隆到RNA表达载体上而获得。这种探针既有寡核苷酸探针的优点，又有cDNA探针的优点。

2、探针的标记 主要可分为放射性标记与非放射性标记两种方法。

（1）放射性标记。常用标记探针的放射性核素有32P，35S，14C，3H，125I。放射性核素的敏感性高，方法简便，操作稳定，可应用核乳酸或X光片通过放射自显影的方法检测。3H标记探针的放射性自显影分辨率高，但其曝光时间长；32P与35S，是原位杂交应用多而广的放射性核素，由于其能量高，常在几天内可得到结果，35S优于32P。14C和125I的分辨率差。很少用于原位杂交。

（2）非放射性标记。与放射性核素标记探针相比，非放射性标记具有安全、无放射性污染，稳定性好，显色快而易于观察等特点。其中生物素（Biotin）标记应用最多、最广。还有应用地高辛标记，荧光素标记，碱性磷酸酶标记，溴脱氧嘧啶标记等。

3、杂交的条件 原位杂交的一个主要优点是，其杂交反应的特异性可通过调节反应条件而进行精确的控制。杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度，PH值及杂交液中甲酰胺和盐离子的浓度。碱基的错配可经过控制严格的杂交条件而排除。

DNA分子杂交实质上是双链DNA的变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。

维持DNA螺旋的力主要是氢键的疏水性相互作用。氢键是一种次级键，能量较低。因此，加热、有机溶剂及高盐浓度等均可导致DNA二级结构发生破坏，DNA二级双螺旋解旋，两条链完全结离，但未破坏其一级结构。此过程称为DNA的变性（denaturation）。

变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合形成双链的过程称为复性（renaturation）或退火（annedling）。

复性并不是变性反应的一个简单逆反应过程。复性的过程是相当复杂的，变性过程可以在一个极短的时间迅速完成，而复性则需要相对较长的时间才能完成。如果使热变性的DNA溶液迅速冷却，则只能形成一些不规则的碱基对，而不会完全恢复DNA双链结构。

因此，建立合适的杂交条件是保证核酸原位杂交成败的关键。

（1）温度与DNA的碱基组成，一般变性的温度为85-90℃左右，但这并不是一个常数，若DNA中（G+C）的百分比愈高，变性温度也愈高，一般而言，（G+C）的百分比含量每增加1%，变性温度上升0.41℃左右。

一般情况下，在不含甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。

（2）PH值。溶液的PH值对变性也有一定的影响。PH值在5-9范围内，变性温度值变化不明显。在高PH值下，可使碱基失去形成氢键的能力。当PH值大于11.3时，所有氢键均被破坏，DNA完全变性。

（3）离子强度。离子强度过低，不利于复性，常采用0.15-1.0mol/L溶液进行复性研究。正离子可以封闭磷酸基因的负电荷，使DNA双链的稳定性增加，不利于变性。

四、冲洗

杂交后冲洗是减低非特异性杂交的关键步骤，其SSC的浓度可低至0.1×SSC。

应用放射性核素探针时，冲洗可达几小时，而用生物素及地高辛等标记的探针冲洗时间则可缩短为15分钟。

冲洗时温度不能高于50℃，否则将导致组织细胞结构的破坏及组织或细胞从切片上脱落，使实验失败。

五、显示

核酸原位杂交结果的显示应体现特异性和敏感性。当DNA探针长度超过0.5Kb时非特异性杂交增多，本底增高。此外，探针与无关基因中部分同源顺序的非特异性结合亦是非特异性杂交的原因之一。除探针的非特异性结合外，检测系统亦是导致非特异性结果的原因之一。生物素标记的探针，常用免疫组织化学技术检测，在许多组织中因含有内源性生物素（维生素H）而出现假阳性结果。地高辛标记就不存在这种问题。

高度敏感是原位杂交的优点之一，用放射性标记的DNA探针可检测到细胞内20个拷贝的mRNA。组织的固定与杂交条件对敏感性也会产生影响。组织切除后若不及时固定，可能会由于mRNA的降解而影响结果导致假阴性的出现。探针的长短、浓度、在组织中的穿透力、杂交及杂交后的冲洗严格性、检测系统的灵敏性等都可产生假阳性或假阴性结果。

核酸原位杂交的高度敏感性和特异性，如果没有确切的阳性或阴性对照则很难加以评定，因此，除探针的选择应通过鉴定外，必须在每一次试验中选择阳性或阴性对照。阳性对照可选择①Northern或Southern印记杂交，②将原位杂交与免疫组织化学联合应用。③用不同互补探针与靶核酸杂交。阴性对照可选择①用非标记cDNA预杂交，②用无关的非特异顺序（如载体）等作探针，③杂交前用RNA酶或DNA酶消化处理切片。