解放军文职招聘考试分子生物学技术

  分子生物学技术

当今，几乎所有的涉及生命的分支学科均已被分子生物学渗透，在分子生物学研究的领域中，随着各种技术的改进和发展，有些已被设备精良的实验室到临床工作的普通实验室安家，使得近10年来，在生命学科的研究中取得了令人瞩目的丰硕成果，特别是在肿瘤、艾滋病、心血管系统疾病，遗传性疾病等方面，均取得了一些突破性进展。将分子生物学技术引入病理学研究领域，无疑为病理学的发展期到了巨大的推动作用，特别是病理学家一旦轻车熟路地在形态学上展示分子水平的各种变化，将组织和细胞的形态学改变和基因、蛋白质的无穷变化有机地联系起来，必将开创病理学研究的新天地，对疾病的病因学、发病学以及形态学等诸方面做出更大的应有的贡献。目前，分子生物学技术在形态学研究中应用最为广泛和最为成功的是核酸的原位杂交技术和原位 PCR技术。

第一章   核酸原位杂交技术

分子生物学技术的突飞猛进发展，也推动了病理学的进展。原位杂交技术时分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一，是核酸分子杂交技术中的一种。

核酸原位杂交技术最早应用于60年代末期，但当时仅限于对体外条件下啊核酸分子片段的初步工作，直到1975年才见到较为系统地介绍在细胞内进行原位杂交的技术。而在常规福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中进行简便易行的原位杂交则是在80年代中后期。近年来，随着方法更为完善，应用也更加广泛，使原来用电镜和免疫组织方法达到的亚细胞和抗原决定族水平的分辨能力提高到了核酸分子的水平，将病理组织学观察到的细胞面貌更直实更微细更精确地展示出来。

第一节     核酸原位杂交的基本原理

核酸分子杂交是只具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。这一杂交过程具有高度的特异性。

杂交的双方时待测核酸序列及探针。待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA核细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（原位杂交）。

用于检测的已知核酸片段称之为探珍（probe）。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

由于DNA分子双股螺旋在一定条件下可以解开（退火），而解开的双螺旋经重新配对后又能形成新的螺旋（复性），针对这一生物学特性，就可以用已知的核酸片段去检测未知的核酸分子，并能确定其所在的部位，达到定位和定量的目的。例如，用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以便有无该病原体的感染。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受统一组织中其他成分的影响，因此，对那些细胞数量少而散在分布于其他啊组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便。

原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保护组织和细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。