解放军文职招聘考试卵白素和生物素免疫组织化学染色

   染色步骤

一．卵白素和生物素免疫组织化学染色

1．标记卵白素—生物素（LAB）技术

（1）石蜡切片常规脱腊入水。

（2）0.3%H2O2—甲醇10分钟，水洗。

（3）PBS洗3次。

（4）加生物素(Biotin)标记的特异性一抗，37。C30分钟，置湿盒内。

（5）PBS洗3次。

（6）加酶标记的卵白素（Avidin）, 37。C30分钟。

（7）PBS洗3次。

（8）DAB显色。

（9）流水冲洗，复染、脱水、封片。

2．桥式卵白素-生物素（BRAB）技术

（1）同LAB技术（1）--（5）

（2）加卵白素（Acidin）37。C30分钟。

（3）PBS洗3次。

（4）加酶标记的生物素(Biotin), 37。C30分钟。

（5）同LAB技术（7）--（9）

3．卵白素—生物素---过氧化物酶复合物（ABC）技术（三步法）

（1）同LAB技术（1）--（2）

（2）必要时胰酶消化，37。C30分钟。

（3）蒸馏水洗，PBS洗2次。

（4）正常羊血清（1：5-10）室温，10-20分钟。

（5）特异性抗体适当稀释，置湿盒中37。C60分钟或4。C过夜。

（6）PBS洗3次。

（7）生物素化（Biotin）第二抗体，37。C20分钟。

（8）PBS洗3次。

（9）ABC试剂，37。C30分钟，置湿盒中。

临用前将试剂A与试剂B等量混合，稀释为1：100的浓度，滴加于切片上。

（10）PBS洗3次。

（11）同LAB技术（7）--（9）

4．ABC快速法

在大量标本染色或快速切片的免疫组化染色时，可采用ABC快速染色法。

（1）同LAB技术（1）--（3）

（2）PBS洗3次。

（3）用含4%BSA和1%正常血清的PBS作用2分钟。

（4）特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液孵育15分钟。

（5）PBS洗3次。

（6）同LAB技术（8）--（9）

特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液的配制：于染色前30分钟用等体积的生物素化IgG—ABC混合，然后加入经适当稀释的特异性抗体。

5．PAP—ABC(ABPAP)技术

将PAP技术和ABC技术两者结合起来，连续应用，可提高敏感性。染色程序：

（1）切片脱腊入水。

（2）0.3%H2O2—甲醇10分钟，水洗。

（3）0.1% 胰酶消化37。C10--20分钟。

（4）PBS洗3次。

（5）与二抗相同的正常血清1：10，室温10分钟。

（6）滴加适当稀释的特异性抗体，4。C过夜，37。C复温30分钟。

（7）PBS洗3次。

（8）滴加桥抗体（如马抗鼠或氧抗兔IgG,1：200—400），37。C30分钟。

（9）PBS洗3次。

（10）滴加鼠PAP或兔PAP，1：200—500，37。C40分钟。

（11）PBS洗3次。

（12）生物素化IgG（如马抗鼠或氧抗兔）37。C20分钟。

（13）PBS洗3次。

（14）ABC复合物37。C40分钟。

（15）PBS洗3次。

（16）DAB显色，冲洗，复染、脱水、封片，观察。

二．葡萄球菌A蛋白免疫染色

1．SPA—HRP间接法

（1)    同LAB技术（1）--（3）

（2)    用TBS（PH7.6）洗3次。

（3)    滴加特异性抗体37。C60分钟，或4。C过夜。

（4)    TBS洗3次。

（5)    滴加SPA—HRP（1：100—400）37。C30分钟。

（6)    TBS洗3次。

（7)    DAB显色。

（8)    流水冲洗，复染、脱水、封片。

1．    SPA—HRP用于PAP法

（1)    切片脱腊至水洗

（2)    80%甲醇—0.6%H2O2封闭内源性酶5分钟。

（3)    10%卵白素Tris缓冲液洗，20分钟。

（4)    特异性抗体37。C30--60分钟，或4。C过夜。

（5)    TBS（PH7.6）洗3次。

（6)    SPA(1ug/ml)5分钟。

（7)    TBS洗3次。

（8)    PAP复合物（无种属限制）5分钟。

（9)    TBS洗3次。

（10）DAB-- H2O2显色。Mayer’s苏木素淡染。脱水、透明、封片、镜检。

三．凝集素受体的检测步骤：

（1)    石蜡切片脱腊入水

（2)    PBS洗3次

（3)    0.05%胰蛋白酶消化37。C，20分钟

（4)    PBS洗3次

（5)    小鼠肝粉溶液（100ug/ml）或用1%BSA30分钟

（6)    生物素化凝集素37。C，60分钟

（7)    PBS洗3次

（8)    ABC试剂37。C40分钟

（9)    PBS洗3次

(10)DAB显色，复染、常规封片

注意事项：

(1)市售凝集试剂，均为生物素标记，美国Vector公司生产的生物素植物凝集素有10种以上，在检测凝集素受体时，生物素化凝集素要进行适当稀释，以获得较好的显色效果。

(2)生物素化的凝集素需要用ABC或Avidin金标记抗体显示，才能检测出相应的受体，故ABC或Avidin金标记抗体也应有生物素化的凝集素相适应的稀释度，这也是保证显色效果的关键。