解放军文职招聘考试酸溶血试验

 酸溶血试验（Ham’s试验）

1.原理    阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）病人的红细胞由于膜有缺陷，对补体溶血效应的敏感性增加，在酸化的正常血清中（PH6.6~6.8），经37℃孵育，易破坏溶血。

2．试剂

（1）25mol HCl溶液。

（2）8.5g/LnaCl溶液。

3．方法

（1） 取患者血4ml于有小玻璃珠的三角烧瓶内，轻摇使脱纤维，将此去纤维血用生理盐水洗涤红细胞3次,  配成50%红细胞悬液。

（2） 取患者血4ml（不抗凝），待凝固后分离血清。

（3） 按（1）、（2）方法取与患者同型或AB型正常对照的血制备红细胞悬液和血清。

（4） 取2支小试管，按下表操作。

实验操作步骤

反应物                      待测管          对照管

健康人血清(ml)               0.5               0.5

患者50%RBC悬液(ml)       0.025               —

健康人50%RBC悬液(ml)      —               0.025

0.25molHCl(ml)               0.5                —

（5） 两管均加塞，置37℃水浴中1小时。

（6） 直接观察或低速离心后观察两管有无溶血现象。

4．结果判断

待测管溶血、对照管无溶血为阳性；两管均无溶血即为阴性。

5. 质量保证

（1）本试验不用抗凝血，因抗凝剂会阻碍溶血，降低灵敏度。一般用脱纤维蛋白血或抽血后立即注入生理盐水中洗涤。

（2）一切用具要干燥，针头要粗，红细胞悬液要直接滴入液体，不要沿管壁流下，以免溶血。

（3）正常血清要新鲜，以免补体失活，造成假阴性。

（4）血清酸化后试管用塞盖好，避免因二氧化碳逸出降低了血清的酸度，以致溶血程度降低。

6.临床意义   结果阳性主要见于PNH。

（四）高铁血红蛋白还原试验（MHb-RT）

1.原理    高铁血红蛋白还原试验(methemogobin  reduction  test, MHb-RT)是用亚硝酸钠使血液中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白,当红细胞内的G6PD含量正常时,由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH,可作为血液中高铁血红蛋白还原酶的辅酶,在递氢体美蓝的参与下,使高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。如G6PD含量不足或缺乏时，则高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。通过测定高铁血红蛋白的还原速度来间接反应G6PD活性。

2. 试剂：

（1） 12.5g/L亚硝酸钠—葡萄糖溶液：亚硝酸钠1.25g，葡萄糖5g，加水至100ml，棕色瓶4℃可保存一个月。

（2） 0.0004mol/L美蓝溶液：美蓝15mg放乳钵中，加少量蒸馏水研磨后过滤，再加水至100ml，室温可保存1~2个月。

（3） 0.02M磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：Na₂HPO₄229.5mg，KH₂PO₄52.2mg，加水至100ml。

3. 方法

（1） 取静脉血3ml，加入已有0.3ml 38g/L枸橼酸钠和30mg葡萄糖的抗凝管内。

（2） 离心，使红细胞与血浆之比为1:1(去掉多余的血浆)。

（3） 摇匀，取1.0ml全血，加亚硝酸钠－葡萄糖液和美蓝溶液各50ul，颠倒混匀12次，使与空气中的氧充分接触。加塞，37℃水中浴孵育3小时。剩余血未加试剂亦同时放入37℃水浴中孵育3小时。

（4） 取出孵育后摇匀的全血0.1ml加入含10ml 0.02MPBS溶液的试管中，2min后于721分光光度计635nm处比色，水调零，测其光密度为A。

（5） 另取未加试剂的全血0.1ml，同（4）操作，测其光密度为B。再于此液中加亚硝酸钠-—葡萄糖液1滴，摇匀，放置5min后比色，测其光密度为S。

4. 计算

     高铁血红蛋白还原率%=（1-）×100%

5. 正常参考值

      高铁血红蛋白还原率>75%为正常，74%~31%为中间缺乏者（杂合子），<30%为显著缺陷（半合子或纯合子）。

6.质量保证

（1） 红细胞比积对结果有一定影响，比积<30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低。故血浆与红细胞之比应严格控制在1：1（相当于红细胞比积35%~45%）。

（2） 抗凝剂以38g/L的枸橼酸钠或ACD液为好。草酸盐不适于本法。

（3） 血液保温后必须充分混匀，再吸取，否则结果可能稍大于100%。

（4） 如果溶血液显示混浊，则不能直接比色，可能有不稳定血红蛋白存在，也可能因患者有珠蛋白生成障碍性贫血以致红细胞脆性降低。前者可离心后用上清液比色，后者可加入0.1%的皂素1滴，放置10~15min，待红细胞溶解后再比色。

7.临床意义   G6PD缺乏时,高铁血红蛋白还原率下降。蚕豆病和伯氨喹啉型药物溶血性贫血等患者，均可出现下降结果。G6PD中间缺乏值（杂合子）还原率为31%~74%，脐血为41%~76%；G6PD严重缺乏值（纯合子）还原率小于或等于30%，脐血小于40%。