解放军文职招聘考试Hb电泳(HbA2定量)

 Hb电泳(HbA2定量)

1.原理    血红蛋白电泳（hemoglobin  electrophresis）的目的是检出和确认正常和异常血红蛋白。由于不同血红蛋白所带的电荷的差别，可将其分离和鉴别。正常人血红蛋白A、F、A₂，在PH8.6缓冲液中电泳，它们均由负极端移向正极端。其移行速度以HbA最快、HbF次之、HbA₂速度最慢。以醋酸纤维素薄膜作支持物作血红蛋白电泳具有简便、快速的优点。

2. 试剂

（1）电泳缓冲液(巴比妥缓冲液，离子强度0.06，PH8.6)

     巴比妥钠                6.38g(分子量206.18)

     巴比妥                  0.83g(分子量184.19)

     水加到500ml

（2）浸膜缓冲液(TEB缓冲液，PH9.0 ,0.12M)

     Tris                     20.2g

     EDTANa₂·2H₂O          2g

     硼酸                     1.5g

     加蒸馏水至1000ml

（3）染色液：氨基黑10B        0.5g

             甲醇              50ml

             冰醋酸            25ml

             水                40ml

（4）漂洗液：无水乙醇45ml,冰醋酸5ml,水50ml。

（5）浸出液：0.4MNaOH

3. 方法

（1） 制备Hb液：新鲜抗凝血（枸橼酸钠抗凝）离心去血浆，用生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入与红细胞等体积的蒸馏水，剧烈震荡，使红细胞彻底溶解，加1/2体积的四氯化碳，震荡，用4000r/min离心20min，吸取上层血红蛋白液备用（此血红蛋白液浓度为100g/L）。

（2） 点样：取出醋纤膜（已用浸膜液浸泡至少20min）用滤纸吸去多余液体，在粗糙面距阴极端1cm处点上血红蛋白液。同时平行点上正常血红蛋白液作对照。点样要求均匀、直、细。将膜置于电泳槽支持板的滤纸桥上（点样面向下）。

（3） 电泳：110V，40min。

（4） 染色、漂洗：取出电泳后的醋纤膜放于氨基黑10B染液中染色5min，然后用漂洗液漂洗数次至无血红蛋白区带处接近无染料色为止。

（5） 定量：剪下HbA2和HbA带,分别放入3ml和12ml的0.4MNaOH溶液中，振摇，使色带完全洗脱，620nm波长，用空白调零。

4. 计算

          HbA₂=

5. 正常参考值：<0.03。

6. 质量保证

（1） 点样过多，色带易脱落或染色不透（尤其是HbA带），会造成HbA₂相对增高，出现假阳性结果。

（2） 电泳后的HbA₂和HbA要充分分开，否则影响测定结果。

（3） 洗脱时要将Hb完全洗脱，否则影响测定结果。

（4） 剪带时将HbF部份剪入HbA，HbA₂带要严格控制。

7.临床意义  

（1） 通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如HbH、HbE、HbBarts、HbS、HbD、HbC等血红蛋白异常疾病。

（2） HbA₂增多时，见于b珠蛋白合成障碍性贫血，为b珠蛋白合成障碍性贫血杂合子的重要实验室诊断指标。HbE病时也在HbA₂区带位置处可使HbA₂增浓，但含量较大，在10%以上。HbA₂轻度增加还可见于肝病、肿瘤和某些血液病。

（六）抗碱血红蛋白（HbF）测定

1.原理    HbF对碱性物质有较大的抵抗力。当血红蛋白溶液中加入1/12mol/L氢氧化钾作用1分钟，HbF不发生变性、而其它Hb在碱性溶液中可变性，被加入的酸性半饱硫酸铵沉淀而终止反应，测定其滤液中Hb含量求抗碱血红蛋白百分含量。

6.         试剂

（1） 1/12mol/LKOH溶液：用1mol/L KOH溶液稀释后标定。

（2） 酸性半饱和硫酸铵：取硫酸铵400g于500ml水中，置37℃水浴24小时，不断搅拌使达到饱和，再冷却至25℃，搅拌一次，使过量的硫酸铵析出，上清液为饱和硫酸铵溶液。取出此液400ml，加1mol/LHCL20ml，蒸馏水加至800ml，混匀后室温保存。

7.         方法

（1） 取2支试管，1支为对照管，别1支为测定管。对照管先加蒸馏水10ml，再加Hb液50ul，混匀待测。

（2） 于测定管加入1/12mol/L KOH1.6ml，在于25℃水浴中预温，待温度衡定后，加入0.1mlHb液，同时开动秒表，摇匀数秒钟，至1分钟整，立即加入半饱和硫酸铵3.4ml，倒转混匀6次，静置10min，滤取上清液待测。

6.           用721分光光度计比色，540nm波长，水调零。

8.         计算

HbF=

5. 正常参考值

    新生儿很高，占0.31~0.96，以后逐渐下降，三个月后迅速下降，2岁降至正常成人水平。正常成人<0.022（血研所）。

6. 质量保证

（1） Hb溶液必须新鲜，最好当天制备，不能在冰箱中反复冻溶，否则HbF变性后抗碱性能力减弱，可使结果偏低。

（2） 碱液的浓度和碱化时间要准确。

（3） 不同滤纸对结果有影响，故所用滤纸须经选择，而且固定品种，不要随意更换。

（4） 经变性后的滤液应在1小时内进行比色。

9.         临床意义  

（1） HbF绝对增多   珠蛋白合成障碍性贫血时HbF增加，重型者30%~90%，中间型常5%~30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续性综合征HbF高达100%。

（2） HbF相对增多   骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤、再障、PNH、卟啉病等均可出现相对增多。

（3） HbF生理性增多   孕妇和新生儿期HbF增加。