医药学论文：论复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化和凋亡的影响

1材料与方法
12中药复方复方肝毒清主要由白花蛇舌草、三七、旱莲草、太子参、白芍等8味中药组成，药材均购于广州采芝林医药连锁店。购回后以蒸馏水500 mL煎煮2次，每次30 min，将2次药液合并后浓缩为1 kg/L浓度，冷藏后尽快使用。
14细胞毒性实验(MTT比色法)细胞按1×108/L密度接种于96孔培养板中，至细胞长满单层后，弃培养液。FAC设800、400、200、100、50、25、125、625 μmol/L共8个浓度，复方肝毒清设10、2、04、008、0016、0003 2、0000 64、0000 128 g/L共8个浓度，每个浓度重复4孔，同时设立正常细胞作为对照组，继续培养24 h后，加MTT溶液(5 g/L)20 μL/孔，37℃孵育3 h。吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL/孔，震荡20 min，全自动酶标仪测定各孔吸光度(D)值，测定波长为490 nm。计算细胞生长抑制率：p抑制=(D对照组-D给药组)/D对照组×100%。选择最大无细胞毒作用的FAC和中药浓度进行以下实验。
16HSC细胞αSMA表达及细胞凋亡的检测
162HSC细胞αSMA表达检测弃上清，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，用40 g/L 多聚甲醛固定30 min，蒸馏水漂洗晾干。以体积分数30% H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗1~2次。滴加体积分数50 g/L牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温20 min，甩去多余液体。滴加适量一抗(1 ∶100~1 ∶500稀释)，37℃、1 h，PBS(pH 72~76)洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20℃~37℃、20 min,PBS洗2 min×3次。滴加试剂链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)，20℃~37℃、20 min,PBS洗5 min×4次。DAB显色，蒸馏水洗。苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。