医药学论文：浅探转基因显微注射中的基因装液方法改良

摘要：目前常用的转基因动物制备方法有显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、人工酵母染色体法及电转移法等[16]。其中显微注射仍是最可靠、最广泛使用的一种方法,因其外源基因整合效率高,对目的基因无大小限制,且可以直接获得纯系[78]，但其过程烦琐且要求严格,将基因液装入微注射针是其成功的关键前提[910]。当前各实验室普遍使用可编程微量注射仪,该仪器要求将基因液面倒吸至注射针的直管部以获得稳定平衡压力,但仅用其吸入功能无法达到,导致培养液倒吸,基因液被稀释,从而大大影响了转基因成功率。笔者建立一种简单有效的方法以克服这一缺点。

关键词： 动物 遗体修饰 小鼠 转基因 显微注射 基因转移技术
1 材料与方法
1.2 仪器参数
1.2.2 可编程微量注射仪 Input：60～100 psi（1 psi=6.895 kPa）；CLR：60～70 psi,0.1 s；BALN：0.8 psi；FILL：60 psi,60 s；INJ：0.5～0.8 psi,0.02 s。
1.3.1 注射针制备 设定对应的拉针仪参数,装上毛细玻璃管,用固定旋钮固定好,按下拉针仪开关,将其拉制成开口小于1 μm的注射针；取下注射针装在煅针仪的持针架上,将注射针移至玻璃球侧面,使其内径20 μm处靠近玻璃球,设定好煅针仪的温度参数,点压加热开关,将其弯成25°。
1.3.3 基因液的装载及比较 将相同参数下制备的注射针分成2组,每组3根,分别按照下面2种方法将基因液装入针内。
1.3.3.2 改良法（B法） 用微载管吸取少量（约5～10 μL）灭菌石蜡油并从显微注射针的背部注入,直到液面到达注射针的直管部（图1）,小心取出微载管,通过橡胶管将注射针背部与注射器相连,按压注射器活塞对石蜡油轻轻施压,使得针内液面向针口缓慢移动,最终充满整个注射针尖部；后续操作同1.3.3.1。
Fig 1 Representation of each part of microinjection pipette
1.3.4.1 平衡压力的观察 保持显微注射仪所有参数不变,将M2培养液装填于3.5 mm培养皿盖并置于倒置显微镜的载物台上,调整注射针角度,驱动显微操作臂使其缓缓下降进入M2培养液中,在倒置显微镜20×物镜下调节焦距至基因液液面清晰,观察注射针内基因液液面的位置变化,以判断此时显微注射仪提供的平衡压力是否能够抵消培养液的虹吸效应,产生使基因液缓慢外流的正压。
1.3.4.3 液面变化数值统计学处理 调节焦距至基因液液面清晰,记录此时基因液液面在目镜测微尺上的刻度（起始位置）,10 min后再次观察并记录液面在目镜测微尺上的刻度（终止位置）。将2组注射针内基因液液面在10 min的位置变化差值进行统计分析,并作配对资料t检验,采用MicroCal Origin 3.0软件中的t检验(two population/pared),检验水准取α＝0.05。
2.1 基因液的装载及比较 用A法装载基因液后,按压"FILL"按键,基因液倒吸入注射针内,当液面上升到注射针尖细部一定位置后,再按压"FILL"按键多次,注射针内液面没有明显变化。而B法的注射针内石蜡油与基因液界面仍然可以上升,甚至到达注射针直管部。
2.2.1 平衡压力的观察 分别使用2种方法装载基因液后,将注射针缓缓下降进入M2培养液中,在倒置显微镜20×物镜下都观察到注射针内基因液液面缓慢向针尖方向移动。
2.2.3 液面变化数值统计学处理 A组注射针内基因液液面在10 min的位置变化为12.5、3.5、6.0，x±s为7.33±4.65；B组为-6.5、-6.0、-8.5，x±s为-7.00±1.32（差值为正表示针内液面向针尖方向移动,差值为负表示液面向针背方向移动）。两组数据比较具有统计学意义（P< 0.05）。