【理学论文】定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

     摘要:定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan- titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR) 四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量 RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

    关键词:相对定量RT-PCR;竞争性定量RT-PCR;比较定量RT-PCR;实时定量RT-PCR定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase- PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种检测特定基因表达量的技术。它是继Northern 杂交、原位杂交、核糖核酸酶保护分析法等方法之后发展的一种新技术[1],与前面几种方法相比,定量 RT-PCR更准确、灵敏和高效[2],它甚至可以检测单个细胞的mRNA的表达水平[1]。这项技术最初主要用于医学领域[3-4],后来不断被其他领域所应用,本文主要对其在植物学中的应用进行综述。

 　定量RT-PCR的原理与分类定量RT-PCR包括mRNA的反转录和定量PCR 两个基本过程,其中定量PCR的基本原理是在PCR 扩增的指数期,PCR产物的量的对数值与起始模板植物营养与肥料学报2007,13(3):520-525 Plant Nutrition and Fertilizer Science量之间存在线性关系。因此定量RT-PCR的原理是根据PCR扩增产物的量确定目标基因的表达水平。根据定量测定的时间,定量RT-PCR可分为实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)和终点定量RT-PCR(End point measure quantitative RT- PCR)。根据参照物的不同,终点定量RT-PCR又分为相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR (Competitive quantitative RT- PCR)[1]、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)。

 　相对定量RT-PCR 相对定量RT-PCR是用内源基因的表达作为参照,同时逆转录产生靶基因和参照基因的cDNA,然后进行PCR共扩增,最后根据参照基因推算靶基因的相对表达水平[5]。PCR的扩增条件和参照基因的选择是相对定量RT-PCR准确性的关键,因此,必须在PCR扩增的指数期进行定量。相对定量RT-PCR 的前提是假设所有样品中参照基因的表达水平是恒定不变的,因此,实验过程中通常使用管家基因 (House-keeping gene)作为参照基因,如肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、rRNA等基因。然而,有些管家基因在不同的组织或不同的处理中表达差异显著, 如圆叶锦葵(Malva pusilla)被Colletotrichum感染后, 肌动蛋白的表达明显升高[6];另外,植物和病原真菌的rRNA的同源性很高[7],在植物病理学研究中 rRNA也不适合作为参照基因。因此应根据研究对象慎重选择内源参照基因。 Burleigh[8]首次将相对定量RT-PCR应用于植物学研究领域,利用18S rRNA基因作为参照,研究丛枝菌根真菌对植物根系中磷转运子(Phosphate trans- porter)和氮转运子(Nitrate transporter)基因表达水平的影响。

    在扩增反应结束后,将扩增产物用限制性内切酶消化以区别靶序列和对照序列的产物。然后通过凝胶电泳和放射性标记自显影分析,以及一系列的计算分析即可定量靶序列的初始浓度[11]。2)构建与靶序列存在大小差异的靶序列的同源序列作为竞争性对照序列。一般是先将靶序列反转录获得cDNA,然后通过分子克隆的手段切掉其中一段DNA序列,最后通过体外转录的方法就可以获得比靶序列分子小的对照序列。此外,还可以构建含有多个基因的对照序列,同时分别设计多个引物,以对不同的mRNA进行定量[12]。 Valter等[13]利用竞争性反转录定量PCR技术测定肿瘤坏死因子的相关因子CD30L的表达水平。实验结果显示,如果样品量很低,则无法满足North- ern杂交的检测要求;而竞争性反转录定量PCR技术却仍然适用,可以检测稀少贵重样品中的特异基因的表达水平。Christiane等[14]利用竞争性反转录定量PCR技术检测样品中病原菌Staphylococcus au- reus的组成型基因gyr和诱导性基因hla的表达,结果表明竞争性反转录定量PCR技术不仅重复性好, 其灵敏度也非常高,能检测到104(gyr)和103(hla) 个拷贝的水平。该技术克服了相对定量RT-PCR中由于内源参照基因表达不稳定,以及参照基因与靶基因的PCR扩增效率差异造成的误差,显著提高了实验的重复性。但是参照基因的构建相对麻烦,可以根据研究目的的不同选择。

   比较定量反转录PCR 如图1所示,比较定量反转录PCR利用不同的寡聚dT引物(Primer1和Primer2)分别逆转录合成不同样品中靶基因的cDNA(cDNAⅠ和cDNAⅡ),引物的5'和3'分别为相同的引物结合序列(PBS)和寡聚 dT,但是其中间隔区的序列长度不同(分别为10nt 和50nt)。然后将逆转录产物等量混合,用与PBS和靶基因的特异性序列互补的引物进行PCR扩增,由于逆转录引物的差异造成不同样品中扩增片段大小不同,凝胶电泳后条带浓度的差异代表了不同样品中靶基因的表达强度。该技术不仅具有相对定量RT-PCR和竞争性反转录定量PCR技术的优点,更重要的是不需要特殊的优化条件,可以直接比较不同样品中同一目标基因的表达水平,而不需要引入参考序列,非常省时经济,越来越为广大研究人员所接受,显示了其强劲的发展势头。