解放军文职招聘考试超薄切片法

 超薄切片法

制备超薄切片的方法包括：普通超薄切片法、

冰冻超薄切片法

快速冰冻置换法

普通超薄切片主要步骤分为组织处理、超薄切片和电子染色三个阶段。

一、组织处理（组织处理的必要性）

（一）取材

1、取材的要求：快、小、准、冷、细、标记

   （1）操作迅速熟练：动物材料在中断血液供应后，其细微结构几乎立刻开始发生改变，故要求取材动作要迅速熟练，不致因耗时多而引起死后变化。

   （2）组织块体积小：制备电镜标本所用固定剂穿透能力弱，同时包埋剂的渗透能力也是有限的，为确保固定剂和包埋剂充分渗透到组织的各个部位，一般要求组织块体积以1mm³为宜，因此，组织离体后，细切为1mm³或更小的组织块是非常重要的。在超微病理活检中，常会遇到因组织块过大，未经细切而引起组织自溶等人工损伤，失去诊断价值。

   （3）取材部位准确：根据研究目的和观察对象的要求，确定取材的位置。在临床病理活检时，要特别注意多点取材，避免电镜一孔之见的弊病，才能对病变组织器官有全面了解，不致做出错误的诊断或评价。

（4）低温下操作：脱离血循环的生物材料，细胞内的各种水解酶可以引起蛋白质、核酸水解，自溶作用使细胞的超微结构发生变化。为了减少细胞水解酶自溶作用的影响，要求在低温（0-4℃）下进行取材，固定剂和取材器械、容器等应预冷。

   （5）操作细致：电镜取材的过程要求动作迅速，但不能粗糙。应尽可能地动作轻巧，所使用刀片器械等锋利得手，切割时避免牵、拉、压、挤，防止细胞的机械损伤。

   （6）做好标记：进行电镜观察的目的无非是科学研究和病理诊断，因而组织块投入固定液小瓶时，应注意做好标记，在瓶签上著名组别、编号等，在取材以后得处理过程中也要注意这个问题。

2、实验动物取材：1mm³大小，1~2分钟投入固定液。

3、临床活检取材

 （1）外科活检：  1~4mm厚，修成1mm³大小；

 （2）针刺活检： 迅速投入固定液并细切成1mm长的小段。

（二）固定

1、固定的目的

利用化学的或物理的方法，终止细胞的死后变化，尽可能完整地保存细胞生活状态下的结构和成分。避免因细胞自身酶的分解作用而出现自溶或因外界微生物而发生腐败，致使细胞超微结构遭受破坏。

2、理想固定剂与良好固定的标准

（1）理想的固定剂应具备的条件

①穿透力强；

②能够稳定细胞的结构和化学成分，使其保持在原位；

③将细胞内的成分（蛋白质、脂类等）变为不溶状态；

④保存细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能集团，以供电镜细胞化学测定；

⑤能够增强图像的反差。

（2）良好固定的形态学标准：

固定效果良好时，一般来说细胞的膜系结构线条清晰、连续而不断裂、细胞基质中充满均匀的精细颗粒，不见明显的空白区和颗粒聚集现象。细胞核结构（核膜、核仁、染色质等）层次清晰，无染色质不规则的聚集和异常的空白区。

3、影响固定的因素

（1）PH   7.2~7.4  

（2）渗透压

（3）时间  取得充分的固定效果而时间尽可能短

（4）温度  0~4℃

（5）固定液的浓度  四氧化锇1%，醛类1%~4%

（6）固定液的用量  10~20倍于组织块的体积

4、常用固定剂

（1）常用四氧化锇（OSO4）

优点：①对脂类有良好的固定效果；

        ②强氧化剂，与氮原子亲和力强，与蛋白分子形成交联，稳定蛋白质；

        ③锇与固定的细胞成分结合后使图像反差增高，即“电子染色”作用；

        ④组织块不发生变形，不收缩和膨胀。

缺点：①对糖类与核酸的固定效果差；

②因其分子较大，穿透力弱，进入组织速度较慢；

③是酶的钝化剂，使细胞酶活性降低，不宜用于细胞化学研究；

④固定时间过长会使组织变脆，细胞成分抽提；

⑤其熔点较低，易挥发出蒸汽，伤害眼鼻等粘膜；

⑥价格昂贵。

（2）戊二醛：

优点：①有两个醛基，可很好地固定蛋白质；

 ②对糖原和糖蛋白有良好的保护作用，弥补了O_SO₄的不足；

③渗透力优于O_SO₄；

④能很好地保存酶活性，可用于细胞化学的研究；

⑤可较长时间保存固定组织，适于临床和野外取材远距离携带或邮寄。 

缺点：①对脂类固定效果差，

      ②无电子染色作用，不能增加图像的反差。

通常将戊二醛和四氧化哦联合作双固定，即戊二醛前固定，四氧化锇后固定。

（3）多聚甲醛：

渗透力强，固定迅速，可以良好的固定结构致密的组织。多聚甲醛和戊二醛常结合使用。

（4）高锰酸钾：

 强氧化剂，是磷脂蛋白的良好固定剂，可用于细胞膜性结构的固定。

5、固定方式：

 （1）双固定法：常用戊二醛作前固定，OsO4作后固定。适用于大多数情况

（2）体内原位固定法  

（3）灌注固定法：特别适于解剖取材困难的柔软组织或难以渗透、死后变化快的组织和器官。

（三）漂洗

1、目的：前固定后使用配制固定液所用同系缓冲液充分漂洗，以除去残留的固定液，双重固定时，必须将戊二醛洗净，才能进入四氧化锇；四氧化锇固定后，必须充分洗去残留的四氧化锇，以免其与脱水剂作用。

2、方法：0.1molPBS10min/次，共3次

（四）脱水

 1、目的

①包埋介质充分渗透到组织内部；

②水分残留会导致电镜在真空状态下引起样品的急剧变化而无法观察。

2、常用脱水剂：乙醇、、丙酮

3、方法：梯度脱水，由低浓度向高浓度逐级脱水。50%-70%-80%-90%-95%-100%

4、注意事项：

①脱水要充分；

②根据材料的致密度和块的大小，适当增减脱水时间；

③如果脱水组织需过夜，可置留于70%乙醇或丙酮中。

（五）浸透

     目的：用包埋剂逐步浸入组织块中完全替代、置换脱水剂，这是包买的重要步骤，浸透不充分，将给切片造成困难，若浸透时间长，细胞成分易被抽提。温度对浸透亦有影响。

（六）包埋

     1、目的：使浸透到组织块内部的包埋剂在一定条件下（温度或紫外光照射）聚合为包埋块，使细胞、组织获得适当的硬度、韧度和弹性，以能承受切片力的作用，最后能够切出超薄切片。

2、理想的包埋剂：

①聚合前粘度适中，能迅速而均匀地渗透到组织细胞内部

②聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，不引起组织变形

③聚合后有良好的切割性，软硬度易于调整

④能经受电子束轰击

⑤高倍放大时不显示包埋剂本身的结构

⑥无毒

3、常用的包埋剂

环氧树脂Epon812，618树脂和Spurr树脂

  包埋剂配方：环氧树脂  Epon812、

加速剂    胺类DMP-30

硬化剂    酸酐类DDSA

增塑剂    MNA

4、包埋方法

①准备工作：胶囊或橡胶包埋模；硫酸纸；牙签；注射器（均需在烤箱内烤干）；

②包埋

③聚合（烤箱内：37℃12h、45℃24h、60℃36h）

（七）快速固定脱水包埋