榄香烯联合生物合成管理论文

【摘要】目的本实验采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌细胞 HcaF，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制探讨抑制/干扰肿瘤细胞的 DNA、RNA 或蛋 白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制以期为判断榄香烯作用的可能靶点提供线索与依据。 方法将 Hca-F 肝癌细胞用榄香烯（50μg/mlμg/mlg/ml）、吡柔比星（THP）（10μg/mlμg/mlmol/ml）、单独和 复合处理，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制设单独瘤细胞（不处理）为阴性对照。Hca-F 细胞浓度均为 1×10μg/ml6/ml，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制每个观 察时间点均设 3 支复管，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用台盼蓝拒染法计算细胞存活率，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制在透射电镜下观察榄香烯与 THP 联合处理对肿瘤细胞超微结构的影响，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果 榄香烯联合吡柔比星处理 Hca-F 比单独使用两种药物的抑瘤率都高。结论本实验所用生物 大分子合成抑制剂不能阻断榄香烯的抗瘤作用，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制提示榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达 依赖性较低。结合榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制提示榄香烯可能作用于肿瘤细胞膜 或细胞中的某些蛋白质（如酶）等而直接杀伤肿瘤靶细胞，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制使对榄香烯抗瘤作用靶点的认 识又进了一步。本实验结果表明榄香烯和 THP 合用可使抗癌作用增强，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制这对榄香烯联合其 他药物治疗肿瘤可能有一定参考意义。 【关键词】榄香烯；抑制剂；肝细胞癌 Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcan cer 【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHcaFcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofma cromolecularsynthesis，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制theirproliferation，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制survival，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制cellcycle，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制apoptosisandmorphology wereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制RNAandproteinontheantitumoref fectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofelemene.MethodsTheHcaFcellsweresingledormingledtreatedwithelemene（50μg/mlμg/mlg/ ml），观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制aloneorcombinedwithTHP（10μg/mlμg/mlmol/ml），观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制theHcaFcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHcaFcellsis1×10μg/ml6/ ml，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制ando bservetheimpactontheultrastructureofHcaFcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制andexaminetheap optosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHcaFtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHcaFtreatedwithelemeneonly.ConclusionTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofeleme necouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制RNA ，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制proteinsynthesis，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制binedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable. 【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma 榄香烯(elemene)是从中药温莪术（经鉴定为我国特有新种定名为温郁金，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制 CurcumaWenyujin）挥发油中提取的抗癌有效成分，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制它是一种仅含碳氢(C15H24))，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制分子量 只有 20μg/ml4) 的小分子、脂溶性的倍半萜类化合物，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制此类物质有抗癌活性属我国首报［1］。 动物实验与临床应用均表明榄香烯的抗癌作用确切，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制而且不良反应很低。我们过去的研究 表明榄香烯处理除可抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡外，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制还能增强肿瘤细胞的免疫原性，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制 榄香烯处理能增强肿瘤细胞膜 HSP70μg/ml 的表达，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用表达谱基因芯片技术的研究表明榄香烯 处理引起基因表达谱的变化。过去对榄香烯抗癌作用机制的研究仅限于榄香烯对肿瘤细胞 增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影响，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制关于它的作用靶点及其信号传导通路迄今研究很 少。本实验在上述研究的基础上，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌 细胞 Hca-F，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制探讨抑制或干扰肿瘤细胞的 DNA、RNA 或蛋白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制以期为判断榄香烯作用的可能靶点提 供线索与依据。 1 材料与方法 1．1 动物 Balb/c 系小鼠，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制引自中国医学科学院北京药物研究所，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制由本室自行繁殖提供。 1．2 瘤株小鼠腹水型肝癌 H22 的高淋巴道转移亚系 Hca-F［2］，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制由本校病理学教研 室凌茂英教授赠送，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制本室常规传代、保种。 1.3 主要药品和试剂 1%榄香烯注射液(elemene，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制大连市医药科学研究所)。吡柔比星 (Pirarubicin，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制THP，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制深圳万乐药业有限公司生产)。RPMI164)0μg/ml 培养基 （GIBCO，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制USA）。 1.4)Hca-F 细胞悬液的制备将传代保种的 Hca-F 腹水型肝癌细胞常规接种于小鼠腹腔，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制 0μg/ml.2ml/只，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制收集第 7～8 天的腹水（肿瘤细胞生长最旺盛时期，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制死亡细胞和红细胞含量较 少），观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制HS 液破除红细胞，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制PBS 洗 3 次，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制计活细胞数，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用含 20μg/ml%小牛血清 RPMI164)0μg/ml 培养 液调细胞数至所需浓度。 1.5Hca-F 肝癌细胞的处理将 Hca-F 肝癌细胞用榄香烯（50μg/mlμg/mlg/ml）、吡柔比星 （10μg/mlμg/mlmol/ml）按本室常规方法单独或复合处理，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制设单独瘤细胞（不处理）对照。Hca-F 细胞浓度均为 1×10μg/ml6/ml，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制每个观察时间点均设 3 支复管，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制加入相应的药品，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制以台盼蓝拒染 法于不同时间计数活细胞数，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制计算存活率。 1.6 单纯榄香烯处理和榄香烯联合 THP 处理对 Hca-F 增殖的影响用 MTT 法测其 OD 值。 1.7 榄香烯联合 THP 处理对瘤细胞超微结构的影响［3］Hca-F 细胞用榄香烯、THP 单一或复合处理，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制细胞浓度和处理方法同前，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制处理时间为 1h，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制收细胞，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用 PBS 洗 3 次，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制 以 2.5%戊二醛固定，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制常规包埋制片，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制铀—铅双染色，透射电镜下观察摄片。—铅双染色，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制透射电镜下观察摄片。 1.8 细胞凋亡的检测和细胞周期的测定细胞收集同前，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用 PBS 洗 3 次，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制加入 PI 染色液 染色 30μg/mlmin（避光、室温）。上机检测，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制Cellquest 软件低速获取。用 Modfit2.0μg/ml 软件分析。 2 实验结果 2.1 榄香烯联合 THP 处理对 Hca-F 存活的影响单纯用榄香烯处理，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制Hca-F 的存活率就 明显降低，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制在 30μg/mlmin～1h 的时间内，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制细胞死亡率随着药物浓度增加而增加（表 1），观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制单用 THP 处理，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制也可导致 Hca-F 细胞死亡、蓝染，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制其细胞死亡率也随着药物浓度增加而增加，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制 榄香烯联合 THP 处理，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制肿瘤细胞死亡率可达 10μg/ml0μg/ml%。 2.2 榄香烯和 THP 联合处理对 Hca-F 细胞周期与凋亡的影响实验结果表明榄香烯与 THP 联合处理对 Hca-F 细胞周期变化的影响及凋亡细胞百分率变化与单用 THP 相比也无 明显区别，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制榄香烯处理与不处理 Hca-F 对照组细胞各时相百分率及凋亡细胞百分率变化无 明显区别（见表 2 和图 1）。 2.3 榄香烯联合 THP 处理对 Hca-F 细胞形态学的影响见图 2。图 2 可示：当榄香烯与 THP 联合处理的肿瘤细胞形态发生了明显的变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制细胞核染色质浓缩，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制核缩小，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制细胞肿胀 破裂，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制细胞完整性受到明显破坏，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制而单纯用 THP 处理的 30μg/mlmin 内大多数没有明显改变，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制受 损细胞形态学变化不典型，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制偶可见到凋亡、坏死的细胞，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制但比率并不高。图 1A：对照组； B：榄香烯 50μg/mlμg/mlg/ml；C：THP10μg/mlμg/mlmol/ml； 3 讨论 大连医科大学病理生理学教研室和肿瘤生物治疗研究所从 20μg/ml 世纪 70μg/ml 年代起就开展了 莪术油、榄香烯抗癌作用的机理研究［3～5］。结果表明榄香烯处理能诱导肿瘤细胞坏死、 凋亡，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制增强肿瘤细胞的免疫原性。为了阐明后者与榄香烯诱导肿瘤细胞膜热休克蛋白 （heatshockprotein，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制HSP）表达之间的关系［7］，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制我们采用流式细胞术（FCM）、免疫 组化、RT－PCR 以及基因芯片等技术进行了较深入的研究，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制结果表明，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制榄香烯处理能增 强肿瘤细胞膜 HSP70μg/ml 的表达，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制但不增强 HSP70μg/ml 基因的转录，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制提示这仅仅涉及 HSP 分布 的改变。为较准确展现可能与榄香烯抗癌作用有直接关系的基因表达变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制我们用榄香烯 （浓度为 50μg/mlμg/mlg/ml，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制作用时间 1h）处理人肝癌细胞 HepG2，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制用表达谱基因芯片 （Affymetrix，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制HumanGenome，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制U95APart#，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制510μg/ml4)4)8，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制Lot#9913250μg/ml9913251，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制U.S.A.，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制其上有 12550μg/ml 条寡聚核苷酸）技术研究了榄香烯处理引起基因表达谱 的变化并与未经榄香烯处理的和热休克的 HepG2 细胞对比，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制有 34) 条基因表达发生变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制 19 条基因变化是榄香烯特异的，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制如肝特异转录因子 HNF-6 转录增加，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制肝再生因子（LRF） 的基因表达下降，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制细胞周期调控因子 CDC25Hu2 的基因表达降低，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制凋亡相关分子 BBC3、TRIP 的基因表达下降等，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制采用 RT-PCR 方法验证了 BBC3 和 TRIP 基因的变化 ［6］。 本实验在上述研究工作的基础上研究了榄香烯联合生物大分子合成的抑制剂对 Hca-F 的增殖、存活、凋亡、细胞周期及形态学改变的影响。结果表明本实验所用三种生物大分 子合成抑制剂都不能阻断榄香烯的抗瘤作用。THP 可嵌入 DNA 双链中，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制抑制 DNA 聚合酶 的活性，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制从而抑制 DNA 的复制与转录。拓扑替康能够抑制拓扑异构酶，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制从而抑制 DNA 复 制。两药都不能阻断榄香烯的抗瘤作用。放线菌酮是真核细胞蛋白质合成的抑制剂，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制能特 异阻断蛋白质的合成，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制许多实验常用放线菌酮预处理观察药物作用及细胞代谢、功能、凋 亡等过程对新的蛋白质生物合成的依赖性［7］。放线菌酮预处理并不能阻断榄香烯对 Hca-F 细胞增殖的抑制作用，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制表明榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达依赖性较低。结合 榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制提示榄香烯作用于肿瘤细胞膜或细胞中的某些蛋白质 （如酶）等直接杀伤肿瘤靶细胞。由于榄香烯分子小，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制抗癌作用比较独特，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制尤其是不与其 他抗癌药有交叉耐药性，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制与其他抗癌药联合应用是值得探讨的问题。本实验结果表明榄香 烯和拓扑替康、THP 合用可使其抗癌作用增强，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制这对榄香烯联合其他药物治疗肿瘤可能有 一定参考意义。