衰老模型小鼠脑组织管理论文

【摘要】采用昆明小鼠为实验对象，通过饲喂不同比例的沙棘粉饲料 4 周以后，在抗 疲劳实验中，以血清乳酸脱氢酶(LDH)LDH))活力、血乳酸(LDH)BLA))、肌糖原(LDH)MG))、肝糖原(LDH)LG))等 4 个生理参数为指标观察沙棘粉的抗疲劳效应，结果表明，饲喂 4 周沙棘粉剂的小鼠，其 LDH)、LG) 含量均显著高于对照组；其抗疲劳时间亦显著增长，且抗疲劳实验 30minmin 和 60minmin 后的血乳酸水平均低于对照组。在检测小鼠脑组织的 MDA) 和 G)SH) 含量时发现 4％ ～6％剂量沙棘粉能降低 MDA) 含量，提高 G)SH) 含量，表明沙棘粉能拮抗 D-半乳糖的损伤， 达到维生素相同效果。 【关键词】沙棘粉；衰老小鼠；脑组织氧化还原物质；抗疲劳效果 沙棘制品不仅可以作为饵料中的维生素源，还可制成供人类食用的产品。沙棘果享有 “维生素仓库”和“神秘果”之称，沙棘果中含有丰富的生物活性物质，具有祛痰、利肺、养胃”和“神秘果”之称，沙棘果中含有丰富的生物活性物质，具有祛痰、利肺、养胃、 健脾等功效，对心血管系统、免疫系统、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗辐射损伤等方面均有 显著的药理效应［1］。可以预见，沙棘制品的市场前景十分可观，而目前我国沙棘资源 浪费严重。因此开发利用此资源已迫在眉睫。西部地区政府及种植户迫切希望高等学校、 科研院所开展沙棘资源开发利用的研究，本实验采用沙棘果的干粉作为实验材料，通过饲 喂昆明鼠 4 周以后，进行其抗疲劳效果的研究，为沙棘资源开发利用提供基础性实验参数。 1 材料与方法 1.1 动物来源及实验场所实验动物选自南京安立默实验动物繁殖调剂中心（许可证号 SYXK20min0min2-0min0min59），在分组前选用了出生日龄（4 周龄）及体重都基本相同的昆明小鼠 （雄性）；实验场所为南京大学药业有限公司动物房（许可证号 SCXK20min0min2-0min0min16）。 1.2 实验分组取小白鼠 147 只，随机分成 7 个大组，每组均为 21 只，组 1 作为饲喂添 加复合维生素的对照组，组 2 作为饲喂无复合维生素饲料的空白对照组，组 3～组 7 作为 饲喂添加比例不同的沙棘粉饲料实验组，小鼠均单笼饲养 4 周。 1.3 饲喂剂量及配方每日投喂足量饲料和水，各组饲料配方如表 1。 1.4LDH) 活力、BLA)、MG)、LG) 含量测试抗疲劳实验前，从每组取小鼠 3 只，眼眶放 血制血清送检，测试乳酸脱氢酶（LDH)）活力、肌糖原（MG)）和肝糖原（LG)），LDH) 活 力，参数 King 氏法测定［2］。 1.5 抗疲劳实验抗疲劳试验依陈奇方法［3］，将饲喂 4 周的小组分别取 12 只按小鼠 体重 10min%负重砝码，于水温 25～27℃、40mincm 深、直径为 20mincm 的标本瓶中游泳，进行抗 疲劳试验。待其头部没入水下 5 秒时迅速捞起，记录游泳时间，待其恢复 30minmin 后各取 6 只眼眶放血，制备血清，待送检测试 BLA)，各组剩余 6 只待其恢复 60minmin 后再眼眶放血， 制血浆送检测试 BLA)。 考虑到在对每一只鼠的每一次取血操作时，对动物造成不同程度伤害性刺激，由此引 起的抗疲劳强度无法保持一致，故而设计成每一个实验测定都分批取样，进行一次性采血。 1.6 小鼠脑组织 MDA)、G)SH) 含量取饲喂 4 周的小鼠，每组 6 只，断颈处死，迅速取出 大脑，用冰冷的 PBS 缓冲液制备 10min%脑匀浆，离心后取上清液进行 MDA) 和 G)SH) 含量测 定。测定步骤按试剂盒说明书进行，MDA)、G)SH) 测定试剂盒由南京建成生物工程研究所 提供。 2 结果 2.1 饲喂 4 周后各组小鼠 LDH) 活力、MG)、LG) 与 BLA) 值见表 2。饲喂 4 周后各组小鼠 血液指标初始值，各组取 6 只小鼠眼眶测试 MG)、LG)、BLA) 和 LDH)，因这批动物取自抗疲 劳动物之前，故称为初始数值，表 2 为测试结果。 注：表中不同组的相同指标中，*表示差异有显著性；**表示差异有非常显著性 由表 2 统计分析结果可知，g3～g5 沙棘粉组的小白鼠，其 MG) 和 LG) 含量均显著大于 空白组(LDH)P<0min.0min1)，其中维生素组也显著大于空白组(LDH)P<0min.0min1)；BLA) 含量各组差异无显著性； g4～g5 沙棘粉组和维生素组的 LDH) 活力均显著大于空白组（P<0min.0min1)，说明 4%～6%沙棘 粉在提高小鼠的 LDH) 活力方面达到维生素对照组效果。g6～g7 组变化不显著，说明 8%～ 10min%沙棘粉的效果不明显。 2.2 抗疲劳及血乳酸指标各组随机取 12 只鼠，做抗疲劳实验，于其休息 30minmin、60minmin 两个阶段各取 6 只放血制血清测试 BLA) 含量，各组的实验数据进行均数差 显著性检验，统计结果见表 3。 注：*表示差异有显著性；**表示差异有非常显著性 由表 3 测试结果可推算：饲喂 2%～6%沙棘粉的小白鼠抗疲劳时间比对照组延长 1.17 ～3.64min，且差异有非常显著性（P<0min.0min1)；与维生素组相比，不达显著性，但维生素组 的抗疲劳时间比空白对照组延长 3.36min，且差异有非常显著性（P<0min.0min1)；抗疲劳运动后 30minmin 和 60minmin 血乳酸含量 4%～6%组和维生素组，与对照组相比，差异有非常显著性 （P<0min.0min1)。 2.3 血乳酸变异级差及其恢复速度由于各组抗疲劳运动前的血乳酸含量初始值不同， 故仅仅使用抗疲劳后 30minmin 和 60minmin 的血乳酸含量差异性还不足以说明动物在疲劳运动后 乳酸清除速度大小，因此依据表 3 与表 2 可推算各组血乳酸变异级差和恢复速度，见表 4。 注：BLA) 浓度变异级差：Bt-B0min；恢复速度：(LDH)Bt2-Bt1)/(LDH)t2-t1) 2.4 各组小鼠脑组织 MDA)、G)SH) 含量灌喂沙棘油后各组小鼠脑组织 MDA)、G)SH) 含量 变化见表 5。 注：*表示差异有显著性；**表示差异有非常显著性 由表 5 可以看出，维生素组中，G)SH) 的升高以及 MDA) 的下降相对于空白组都有极其 显著的变化（P<0min.0min1)。g4～g5 沙棘粉组的 G)SH) 的升高以及 MDA) 的下降相对于空白组也 有极显著的变化，但其余各组变化均不明显。 3 讨论 由文镜等的研究［4］可知，动物疲劳后的 BLA) 降低取决于 LDH) 活力，肌糖原和肝糖 原是运动能源。从表 2 可以看到，服用沙棘粉可以提高体内糖原含量，从而使机体抗疲劳 能力增强。在初始条件下，LDH) 活力及肌糖原和肝糖原的测试结果表明，2%～6%沙棘粉 在提高小鼠的 LDH) 活力、肌糖原和肝糖原方面与复合维生素的效果差异无显著性；从而也 可说明饲喂适当剂量沙棘粉的抗疲劳效果与复合维生素差异无显著性。表 3 结果表明：饲 喂 2%～6%沙棘粉剂量的小白鼠抗疲劳时间比对照组长，与饲喂复合维生素组的效果差异 无显著性，表明沙棘对提高小白鼠抗疲劳具有一定效果。剂量在 8%～10min%时效果不明显， 可能为沙棘粉含量较高导致玉米粉含量下降引起。表 4 的推算结果则可以说明疲劳后的 2%～6%沙棘粉组 BLA) 下降比对照组快。由表 5 统计分析可得，饲喂 4%～6%沙棘粉及维 生素的小白鼠脑组织 G)SH) 含量显著高于对照组，MDA) 含量显著低于对照组。说明沙棘粉 对衰老小鼠具有抗衰老作用。 沙棘是目前学术界发现的唯一能把经济效益、生态效益和社会效益集注于一身的作物， 沙棘资源的开发利用研究正日益受到重视。在国际上，那些没有野生沙棘资源分布的国家， 如加拿大、美国、日本、南非等国，近年来对沙棘的研究也十分关注［5］。目前沙棘的 开发产品主要为沙棘油，其保健功能研究正在被应用于医学、保健食品、化妆品、航空航 天医学等领域。沙棘油占沙棘果实的 2%～5%，且提炼复杂，相比而言，沙棘汁占沙棘果 的 70min%以上，在生产沙棘油过程中，许多丰富的营养成分及生理活性物质也富集于沙棘汁 中。本实验充分的证明，适当剂量的沙棘粉能够对动物体产生一定抗疲劳的作用和抗衰老 的作用。因此，未来对沙棘的利用可以不再单单拘泥于沙棘油，沙棘的利用率也能得到大 大的提高。我国沙棘总面积居世界各国之首，占世界沙棘总面积的 95%［6］。如何开发 利用如此丰富的沙棘资源用于造福人类健康生活仍需要进一步地探索和研究。 【摘要】目的观察五福心脑清对多发性脑梗死大鼠的保护作用。方法采用同种大鼠自 然干燥血凝块颈内动脉注入制备多发性脑梗死性痴呆大鼠模型，测定多发性脑梗死大鼠血 清 SOD、MDA) 的含量，观察脑组织形态学改变。结果模型组血清 SOD 的含量下降， MDA) 的含量增高；复方丹参滴丸和五福心脑清各剂量组均可增高 SOD 的含量，降低 MDA) 的含量。五福心脑清可减轻多发性脑梗死大鼠脑组织形态学改变。结论五福心脑清对多发 性脑梗死性痴呆大鼠模型具有保护作用。 【关键词】五福心脑清；多发脑梗死性痴呆；SOD；MDA) EffectofWuFuXinNaoQingoncerebralmulti-infarctiondementiaratmodel 【A)bstract】ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsofWUFUXINNA)OQING)oncerebral multi-infarctiondementia(LDH)MID)ratmodel.MethodsThemultiinfarctiondementiamodelwasinducedbyinjectingcruorembolusofthesamekindratsintotheint ernalcarotidartery.TheSODandMDA)ofserumwasmeasured.A)ndthepathologyofbrainwasob served.ResultsComparedwiththecontrolgroup，thecontentofSODinserumofthemultiinfarctiondementiaratswasreduced，thecontentofMDA)wasincreased.FuFangDanShenDi WanandWuFuXinNaoQingcanreversethecontentofthem.Moreover，themorphologydemo nstratedthatFuFangDanShenDiWanandWuFuXinNaoQingcandecreasethepathologicalde stroyofthebrain.ConclusionTheresultsofthisstudysuggestthatWuFuXinNaoQinghaveprotec tiveeffectsonmulti-infarctiondementiaratmodel. 【Keywords】WuFuXinNaoQing；cerebralmulti-infarctiondementia；SOD；MDA) 血管性痴呆是一系列脑血管因素导致脑组织损害而产生的痴呆症状的总称。在血管性 痴呆中，以多发梗死性痴呆(LDH)MID)发病率最高，且有不断增高的趋势。MID 是由于反复多次 脑缺血发作，或多发性脑梗死、或一次严重的脑血管病引起的智能减退。由于患者的生活 能力下降，严重威胁着老年人的健康和生存质量，给家庭和社会造成了巨大负担，随着血 管性痴呆的发病率绝对及相对地增多，使血管性痴呆的防治研究具有实际应用前景。五福 心脑清由精制红花油、冰片等组成，具有活血化瘀、通络开痹等功效。故本实验通过用大 鼠自体血栓造成的多发性脑梗死模型，观察五福心脑清对此模型的保护作用。 1 材料与方法 1.1 仪器全自动生化分析仪（TBA)-120minFR，日本）。 1.2 试剂与药物超氧化物歧化酶(LDH)SOD)、丙二醛(LDH)MDA))试剂盒购于南京建成生物试剂公 司。五福心脑清软胶囊：0min.4g/粒，由神威药业有限公司提供（批号：0min40min3171），含精制 红花油、冰片、维生素 E、维生素 B6。复方丹参滴丸：天津天士力制药股份有限公司产品 (LDH)批号：20min0min40min30min6)。 1.3 实验动物 Wistar 大鼠，购于北京维通利华公司，SPF 级，雄性，体重 240min～ 260ming。合格证号：SCX（京）20min0min2-0min0min0min3。 1.4 实验分组五福心脑清软胶囊低、中、高剂量组（162、324、648mg/kg），复方丹 参滴丸组，模型组，假手术组和正常组。 1.5 大鼠多发性脑梗死模型的复制参照文献方法复制脑多发性梗死模型［1］，同种 Wistar 大鼠左心室内采血，于 37℃温箱内干燥，研碎后用 20min0min 目筛孔过筛，应用时取血栓 栓子 1mg 加生理盐水 0min.3ml，摇匀成混悬液。10min%水合氯醛按 3.5ml/kg 体重腹腔麻醉，颈 正中切开皮肤，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈总动脉、颈外动脉与 颈内动脉，暂时夹闭颈总动脉以及翼突腭动脉，于颈外动脉逆行插管注入栓子溶液 0min.3ml，推注同时开放颈总动脉，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多发性 脑梗死，开放翼突腭动脉，结扎颈外动脉，缝合皮肤。 1.6 药物干预各组动物于术后即刻灌胃给药，以后每 24h 给药一次，连续 2 周。正常 组、模型组及假手术组：生理盐水灌胃，五福心脑清软胶囊低剂量组五福心脑清软胶囊 162mg/kg 灌胃；五福心脑清软胶囊中剂量组五福心脑清软胶囊 324mg/kg 灌胃；五福心脑 清软胶囊高剂量组五福心脑清软胶囊 648mg/kg 灌胃；复方丹参滴丸组：复方丹参滴丸 36.45mg/kg 灌胃。各组给药体积用生理盐水调整至 10minml/kg。 1.7 指标检测 1.7.1 血清 SOD、MDA) 于复制模型 2 周后，各实验组大鼠球后静脉丛取血，全自动生 化分析仪参照试剂盒说明书检测血清超氧化物歧化酶(LDH)SOD)活性、丙二醛(LDH)MDA))含量。 1.7.2 病理形态于复制模型 2 周后，各实验组部分大鼠 10min％水合氯醛按 3.5ml/kg 体重 腹腔麻醉，经左心室灌注 0min.0min1M 磷酸盐缓冲液，pH) 值 7.4，待灌注液清亮，灌注 4％多聚 甲醛磷酸盐缓冲液 10minmin，取脑，放入 4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液外固定。石蜡包埋，切 片，行 H)E 染色，光镜观察。 1.8 统计学方法数据以 x±s 表示，进行方差分析，F 检验，组间比较，q 检验。 2 结果 2.1 五福心脑清软胶囊对大鼠多发性脑梗死模型血清 SOD、MDA) 的影响见表 1。 实验结果表明，模型组大鼠血清 SOD 活性较正常组降低，各治疗组与模型组比 SOD 活性均有所升高，模型组大鼠血清 MDA) 浓度较正常组升高，各治疗组与模型组比，MDA) 浓度均有所降低。 2.2 五福心脑清软胶囊对大鼠多发性脑梗死模型形态学的影响 H)E 染色结果表明，模型 组可见大片脑组织坏死，坏死区周围可见胶质细胞增生，残余组织可见神经细胞变性，脑 实质有水肿，坏死区的血管可见栓塞。各治疗组脑实质坏死面积明显小于模型组，在皮层 可见筛状软化灶，软化灶周围及坏死灶中可见散在胶质细胞增生，神经元仍有变性(LDH)图 1～ 12)。 3 讨论 ＭＤＡ作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量 的变化可间接地反映组织中氧自由基含量变化。ＳＯＤ作为一种抗氧化酶，有助于清除氧 自由基，具有清除、防止活性氧合成和蓄积，阻断脂质过氧化连锁反应，保护细胞免受毒 害的作用［2］。脑缺血时产生大量氧自由基，细胞内ＳＯＤ减少，氧自由基不能被清除， 细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸的不饱和双酯键易受氧自由基攻击，导致脂质过氧化反应， 激起自由基的连锁-增殖反应，形成一系列的脂质自由基及其降解产物丙二醛(LDH)ＭＤＡ作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量)，这 些脂质自由基将进一步引起细胞膜的流动性降低，加重脑损伤，是导致该模型动物神经细 胞发生迟发性神经元死亡的一个重要原因。 五福心脑清由精制红花油、冰片等组成。红花，其性辛温，归心肝经，具活血通经、 祛瘀止痛的功效，临床用于治疗缺血性心脏病、脑中风等。冰片芳香开窍、醒神，能恢复 神经系统功能，现多用于治疗心脑血管疾病，如脑动脉硬化症、脑萎缩、中风后遗症引起 的神志不清、健忘、痴呆等。近年来开展对醒脑开窍药的筛选研究，观察到冰片本身有直 接的醒神开窍作用，且作用很强，而不止是仅作为“引药”［3］。有研究表明，冰片具有促 进血脑屏障通透性增加和引药上行的作用［4，5］，诸药合用可以起到活血化瘀、醒脑开 窍的功效。 本实验结果，五福心脑清可以使多发脑梗死性痴呆大鼠的血清 SOD 含量升高，MDA) 含量下降，抑制多发脑梗死引起的过氧化损伤，可使脑组织病理形态学改变减轻。提示本 药对多发性脑梗死模型有积极的治疗作用，实验结果为该方药的进一步研究及新药开发提 供了一定的实验依据。