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【摘要】目的探索黄芪提取影响因素的主要范围。方法采用紫外分光光度法测定黄芪 皂苷、多糖含量,比较不同乙醇浓度、温度对水提和醇提黄芪的影响。结果 60%~80%乙醇 浓度范围是醇提工艺优化的主要考查范围;60~100℃温度范围是水提、醇提工艺优化的主 要考查范围。结论该研究结果可以为不同需要的提取工艺设计提供参考。 【关键词】黄芪提取方乙醇浓温度 Effectingfactorsofextractingastragalusroot CAOYu-chao,SHAOChangjiang,HEDian,etal.LanzhouTaibaoPharmaceuticalCo.Ltd,Lanzhou730050,China 【Abstract】ObjectiveToexplorethemaineffectingfactorsofextractingastragalusroot.M ethodsThedifferentextractionsofastragalusrootunderdifferentconcentrationsofethanolandt emperatureswerecompared.ThecontentsoftotalastragalosideIVandpolysaccharideweredet ectedbyUV.Results60%to80%ofethanoland60to100℃oftemperaturewasthemaineffectingf actorsofextractingastragalusroot.ConclusionThedifferentextractionmethodshouldselectthe differentrangeofethanolconcentrationandtemperatureoptimizingextractionprocess. 【Keywords】Astragalusroot;extractionmethod;concentrationofethanol;temperature 黄芪(Radixastragali)Radixastragali)为豆科植物蒙古黄芪 [Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]Astragalusmembranaceus(Radixastragali)Fisch.)Bge.var.mongholicus(Radixastragali)Bge.)Hsiao]和膜荚黄芪 (Radixastragali)Astragalusmembranaceus(Radixastragali)Fisch.)Bge.)的干燥根。味甘,性微温,具补气升阳,益卫固表、托 疮生肌等功效。其化学成分有多糖、皂苷、黄酮等。现代药理研究证明,黄芪多糖和黄芪皂 苷为其中的主要成分,其中皂苷以黄芪甲苷为主,有着广泛的药理作用[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]1,2]。黄芪的有效成分 提取报道较多,但文献报道所取的研究材料黄芪产地、品种等都不同,难以进行系统比较分析。 本文采用同一研究材料,分别研究溶剂、溶剂浓度、提取温度对黄芪皂苷、黄芪多糖的影响, 从中优选出黄芪皂苷、黄芪多糖提取率较高的影响因素范围。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 UV-2450 紫外分光光度计(Radixastragali)日本导津);FA2004B 电子天平(Radixastragali)上海精密科学仪器 有限公司);电热恒温水浴锅(Radixastragali)北京科伟永兴仪器有限公司);电热恒温干燥箱(Radixastragali)连云港医疗器械 设备厂);VP30 型真空抽滤泵(Radixastragali)北京莱伯泰科仪器有限公司)。 1.2 试剂黄芪甲苷标准对照品(Radixastragali)中国药品生物制品检定所);葡萄糖(Radixastragali)分析纯,莱阳化工实验 厂,批号:20050615);香草醛,无水乙醇,苯酚,硫酸,氢氧化钠,均为分析纯;蒙古黄芪药材,陇西制 药厂提供,并经兰州大学药学院生药研究所马志刚教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪 [Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]Astragalusmembranaceus(Radixastragali)Fisch)Bge.Var.mongholicus(Radixastragali)Bge)Hsiao];95%乙醇;蒸馏水自制。 2 方法与结果 2.1 黄芪甲苷标准曲线绘制[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]3]精密称取黄芪甲苷标准对照品 5.1mg,置于干燥的 10ml 容 量瓶中,加适量 90%乙醇于 62℃水浴振摇使溶解,放冷后以 90%乙醇定容。精密吸取 0.15、0.30、0.45、0.60、0.75ml 分别注入具塞试管中,各加入 90%乙醇至 0.75ml,再分别 加入 0.75ml8%香草醛试剂,置于冰浴中缓缓加入 7.5ml72%硫酸摇匀,放入 62℃水浴中恒温 20min,取出冷却摇匀,在 30min 内,于波长 544nm 处测定吸光度(Radixastragali)A),随行试剂空白。以标准 溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为:Y=0.0011X0.0021,r2=0.9943(Radixastragali)n=5),黄芪甲苷在 102~510mg/L 范围内具有良好的线性关系。 2.2 葡萄糖标准曲线绘制精密称取 105℃干燥恒重的葡萄糖标准品 100.3mg,置于 100ml 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8ml 分别置于 50ml 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取上述各种溶液 2.0ml 于具塞试管 中,分别加入 5%苯酚溶液 1.0ml,摇匀,迅速加入 5.0ml 浓硫酸,振摇 5min,置沸水浴上加热 15min,然后置冷水浴中冷却 30min,随行空白,在 490nm 波长处测定吸光度。以标准溶液浓 度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]3]。回归方程为:Y=0.014X0.0003,r2=0.9996(Radixastragali)n=7),葡萄糖在 8.024~56.168mg/L 范围内具有良好的线性关系。 2.3 提取乙醇浓度的选择根据文献资料[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]4]在 70%左右的醇浓度时黄芪皂苷的提取率较 高,因此选择 60%、70%、80%、95%的乙醇进行黄芪皂苷及黄芪多糖的提取。 2.3.1 提取方法称取黄芪药材约 5g,4 份,分别以 60%、70%、80%、95%的乙醇水溶液 煮沸提取,提取两次:第一次溶剂用量为药材量的 10 倍(Radixastragali)质量体积比),提取时间 90min;第二次 溶剂用量为 8 倍,提取时间 60min。提取液过滤、合并、冷却至室温,精密吸取 25.0ml 滤液 于编号的蒸发皿中置于沸水浴挥去乙醇后进行皂苷测定;另精密吸取 50.0ml 滤液于编号并 经干燥称定的蒸发皿中置于沸水浴将溶剂挥至近干,移至恒温干燥箱中在 100~105℃烘干后 放入干燥器内,进行浸膏得率及黄芪多糖的测定。同法提取 6 组。 2.3.2 黄芪皂苷的含量测定将挥去乙醇的提取液分别转移至 50ml 容量瓶中,用蒸馏水清 洗蒸发皿 3 次,洗液并入容量瓶,以蒸馏水定容,摇匀后,过滤,精密吸取续滤液 1.0ml 于 10ml 容量瓶中,以无水乙醇定容,摇匀作为样品液,精密吸取 0.5ml 样品液于具塞试管中,加 0.5ml8%香草醛试液,置于冰浴中缓缓加入 5ml72%硫酸,摇匀,放入 62℃水浴中,保温 20min, 取出置于冷水浴中冷却,摇匀,于波长 544nm 处测定吸光度,随行以 90%乙醇为空白,对照标 准曲线,得出样品的黄芪皂苷含量。 2.3.3 黄芪多糖及浸膏得率测定将干燥至恒重的盛有浸膏的蒸发皿进行称定,减去蒸发 皿的重量即得浸膏量(Radixastragali)总浸膏量进行换算);粉碎浸膏并混匀作为黄芪多糖样品,精密称取各多 糖样品 50mg,以蒸馏水溶解并定容于 50ml 容量瓶,摇匀,精密吸取 1.0ml 此液置 25ml 容量瓶 中,蒸馏水定容,摇匀。精密吸取 2.0ml 于具塞试管中,按标准曲线项下操作。用标准曲线计 算多糖的含量。 2.3.4 不同浓度乙醇提取结果通过 SPSS11.5 的单因素方差分析得:四组皂苷占浸膏%、 皂苷占药材%、多糖占浸膏%及多糖占药材%的方差均不齐,进一步经 Tamhane 分析 得:60%、70%、80%乙醇组分别与 95%组比较,差异有显着性 (Radixastragali)P<0.05)。60%、70%、80%乙醇提取所得黄芪皂苷及黄芪多糖的收率之间的差异无显着 性,95%乙醇提取所得黄芪皂苷及黄芪多糖与其他浓度乙醇提取所得收率的差异具有显着性, 综合图 1 的结果,可以得出黄芪皂苷的含量、黄芪多糖的含量与纯度均与醇的浓度有关,醇提 浓度越高,黄芪多糖的纯度越高,但含量下降,黄芪多糖、黄芪皂苷的含量在 60%、70%、80%乙醇浓度时差异无显着性,在 95%乙醇浓度时含量明显降低,说明 95%的 乙醇不适用于提取黄芪甲苷及黄芪多糖,因此选择 60%、70%、80%乙醇作为提取工艺优化 中乙醇浓度考查的主要水平。 2.4 提取温度对醇提的影响 2.4.1 提取方法分别称取黄芪药材约 5g,在 40、50、60、70、80、90℃水浴及 100℃ 下以 70%的乙醇水溶液进行黄芪皂苷的提取,提取两次:第一次溶剂用量为药材量的 10 倍 (Radixastragali)质量体积比),提取时间 90min;第二次溶剂用量为 8 倍,提取时间 60min。提取液过滤、合并、 冷却至室温,精密吸取 25.0ml 滤液于编号的蒸发皿中置于沸水浴挥去乙醇后进行皂苷测定; 另精密吸取 50.0ml 滤液于编号并经干燥称定的蒸发皿中置于沸水浴将溶剂挥至近干,移至 恒温干燥箱中在 100~105℃烘干后放入干燥器内,进行浸膏得率及黄芪多糖的测定。同法提 取 4 组。 2.4.2 测定黄芪皂苷、多糖的含量测定同“2.3”。 2.4.3 不同温度乙醇的提取结果通过 SPSS11.5 的单因素方差分析得:七组皂苷占浸膏 %、皂苷占药材%、多糖占浸膏%及多糖占药材%的方差均不齐,进一步经 Tamhane 分析得: 60、70、80、90、100℃组皂苷占药材%分别与 40、50℃组比较,差异有显着性 (Radixastragali)P<0.05);70、90℃组多糖占浸膏%分别与 40、50℃组比较,以及 60℃组多糖占浸膏%与 90℃组比较,差异有显着性(Radixastragali)P<0.05);多糖占药材%各组之间差异均无显着性(Radixastragali)P>0.05)。 60、70、80、90、100℃时的皂苷得率与 40、50℃时的得率比较差异具有显着性;而 60、70、80、90、100℃之间及 40℃与 50℃之间的差异无显着性,即其差异不是由于温度 因素造成,而是由于操作的系统误差或偶然误差引起。由图 2 可以得出黄芪皂苷的得率随提 取温度升高而提高,而在 60℃时皂苷得率也相对较高;由于 70%的醇在 90℃时已沸腾,说明 在沸腾情况对皂苷的提取率较高,而黄芪皂苷又有不耐热的特性,温度越高对其的破坏也多, 因此 100℃时的提取效率不如 90℃。 70、90℃组的多糖占浸膏%分别与 40℃、50℃组比较,以及 60℃组多糖占浸膏%与 90℃组比较,差异有显着性,其余各组之间差异无显着性;而各温度组之间多糖占药材%的差 异均无显着性。由图 2 得出多糖纯度随温度升高而降低,说明提取温度高时对于杂质的提取 也增多;与此同时多糖得率随温度升高亦有所升高,提示多糖提取应同时考虑提高提取效率和 减少杂质提出两方面的平衡。 多糖得率作为参考由于其组间差异不具有统计学意义,且与文献[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]5,6]报道有一定的差异, 所以主要考虑皂苷得率,因此选择 60、90、100℃三个温度作为提取工艺优化中温度考查的 主要水平。 3 提取温度对水提的影响 3.1 提取方法分别称取黄芪药材约 5g,以蒸馏水在 50、60、70、80、90℃水浴以及煮 沸条件下进行黄芪多糖的提取,提取两次:第一次溶剂用量为药材量的 8 倍(Radixastragali)质量体积比),提取 时间 120min;第二次溶剂用量为 6 倍,提取时间 60min。提取液过滤、合并于 100ml 容量瓶 中冷却至室温,蒸馏水定容作为样品提取液。同法提取 4 组。 3.2 测定黄芪皂苷、多糖的含量测定同“2.3”。 3.3 不同温度水提取结果通过 SPSS11.5 的单因素方差分析得:6 组皂苷占浸膏%、皂苷 占药材%、多糖占浸膏%及多糖占药材%的方差均不齐,进一步经 Tamhane 分析得:多糖占 药材%70℃组与 100℃组比较差异有显着性(Radixastragali)P<0.05);6 组皂苷占药材%之间差异均无显着 性(Radixastragali)P>0.05)。 经统计学分析得出:70℃组与 90℃组多糖占药材%比较,差异有显着性,其余各组之间差 异均无显着性;而各组之间皂苷占药材%的差异均无显着性。由图 3 可以得出:在 50~60℃、70~100℃时黄芪多糖提取率随着提取温度的升高而有所提高,而 60℃时黄芪多 糖提取率也较高,与文献[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]6]报道一致。而皂苷占药材%的差异不具有统计学意义,因此只考 虑多糖得率,选择 60、90、100℃三个温度作为水提取工艺优化中考查的主要水平。 4 讨论 本文采用同一研究材料,分别研究溶剂、溶剂浓度、提取温度对黄芪皂苷、黄芪多糖的 影响。可以为不同需要的提取工艺设计提供参考。 【摘要】目的用 HPLC 法建立对胃炎康胶囊中的芍药苷定量分析方法。方法采用 DiamonsilC18 色谱柱(Radixastragali)4.6mm×150mm,5μm),m),以甲醇-0.02mol/L 磷酸二氢钾(Radixastragali)25:75)为流动 相;检测波长为 230nm,按外标法定量。结果芍药苷在 0.058848~1.17696μm),g 范围内呈良好 线性关系,相关系数 r=0.99999,平均加样回收率为 99.7%,RSD=0.14%(Radixastragali)n=6)。结论本实验方 法灵敏、准确、可靠,适合该制剂的质量控制。 【关键词】HPLC 法;胃炎康胶囊;芍药苷 【Abstract】ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofpeoniflorininWeiyankan gcapsulesbyHPLC.MethodsTheseparationwasperformedonDiamonsilC18column(Radixastragali)150mm ×4.6mm,5μm),m)withmethanol-0.02mol/ Lpotassiumdihydrogenphosphate(Radixastragali)25:75)asamobilephasebymeansofexternalstandardmet hod.Thedetectionwavelengthwas230nm.ResultsThepeoniflorinhadgoodlinearrelationinthe rangeof0.058848~1.17696μm),g(Radixastragali)r=0.9999).Theaveragerecoverywas99.7%withRSD0.14% (Radixastragali)n=6).ConclusionThemethodissensitive,accurate,reliable,anditcanbeusedtocontrolthequal ityofWeiyankangcapsules. 【Keywords】HPLC;Weiyankangcapsule;peoniflorin 胃炎康胶囊是治胃病的一种常用药,虽然在全国范围内生产厂家多、生产量非常大,但对 这种药的质量控制方面一直按照《部颁标准中药成方制剂第十三册》进行检验,该部颁标准 无含量测定项,由于白芍是君药,所以参照其他文献资料采用高效液相色谱法对白芍的主要成 分芍药苷的含量进行测定,方法简便,精密度较高,可有效对胃炎康胶囊中的芍药苷进行控制, 为药品质量标准的修订和生产工艺的改进提供科学依据。 1 仪器与试剂 惠普 1100 高效液相色谱仪(Radixastragali)惠普公司制造);安捷伦 1100 高效液相色谱仪(Radixastragali)安捷伦公司制 造);芍药苷对照品(Radixastragali)购于中国药品生物制品检定所,类别为供含量测定用);甲醇(Radixastragali)天津市四有生 物医学技术有限公司出品,批号:040118101);乙醇(Radixastragali)天津化学试剂有限公司出品,批 号:20040124);磷酸二氢钾(Radixastragali)北京化工厂出品,批号:990401);胃炎康胶囊(Radixastragali)吉林省七星山药业提 供,批号:20050101,20050102,20050103)。 2 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-0.02mol/L 磷酸二氢钾(Radixastragali)25:75)为流动相;流 速为 1.0ml/min;柱温为 35℃;检测波长为 230nm。本品连续进样时,为了缩短采样时间,应用 梯度洗脱,即第 30~35min 采用甲醇-水(Radixastragali)80:20)洗脱后,然后用甲醇-0.02mol/L 磷酸(Radixastragali)25:75)平 衡 10min 后继续进样。在此条件下,供试品色谱中,在与对照品色谱相同的保留时间处有色 谱峰,与其他组分能达到较好分离。为了使芍药苷色谱峰达到基线分离,定量分析更准确,在 系统适用性试验中规定理论塔板数不得低于 2000。 3 溶液的制备 3.1 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量,加甲醇制成 60μm),g/ml 的溶液,摇匀,即 得。 3.2 供试品溶液的制备取胃炎康胶囊的内容物(Radixastragali)约含芍药苷 3mg),精密称定,精密加入稀 乙醇 50ml,称重,超声处理(Radixastragali)功率 240W,频率 45kHz)50min,放冷,加稀乙醇补足重量,摇匀,滤过, 取续滤液,即得。 3.3 空白对照溶液取按处方比例制成的除白芍的空白胶囊按“3.2”项下方法制成的空白 对照溶液。 4 方法与结果 4.1 波长选择芍药苷的测定波长参照《中国药典 2005 年版一部》白芍药材测定方法,选 定为 230nm。 4.2 空白干扰试验吸取上述对照品溶液、供试品溶液与空白对照品溶液各 10μm),l 注入液 相色谱仪,记录色谱图,结果在芍药苷相应位置上空白对照无干扰。结果见图 1~3。 4.3 最低检出限和最低定量限 4.3.1 最低检出限精密称取芍药苷对照品 13.89mg 置 50ml 容量瓶中加甲醇至刻度溶解, 取 1.6ml 置 10ml 容量瓶中加甲醇至刻度制成含芍药苷 58.848μm),g/ml 的溶液,进样 1μm),l,计算得 芍药苷的最低检出限为 0.058848μm),g,信噪比为 3.0。 图 1 空白对照品 图 2 供试品图 3 芍药苷对照品 4.3.2 最低定量限取上述对照品溶液进样 2μm),l,计算得芍药苷的最低定量限为 0.117696μm),g。信噪比为 21.5。 4.4 线性关系试验精密称取芍药苷对照品加甲醇溶解,制成含芍药苷 58.848μm),g/ml 的溶 液,分别进样 1、2、3、5、10、20μm),l;记录色谱图,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,计算 回归方程为:Y=786.69329-0.139248,r=0.99999。结果表明,芍药苷在 0.058848~1.17696μm),g 范围内与峰面积呈良好的线性关系,近似为过原点的直线,可采用外标 一点法测定。 4.5 精密度试验取芍药苷对照品溶液(Radixastragali)C=59.040μm),g/ml)重复进样 6 次,每次进样 10μm),l,芍 药苷的峰面积 RSD 为 0.3%(Radixastragali)n=6),结果可知:该含量测定方法精密度良好。 4.6 重复性试验取本品内容物,分别精密称取 6 份,含量结果 RSD 为 0.06%,结果表明该 方法重复性良好。 4.7 回收率试验取胃炎康胶囊(Radixastragali)批号:20050101,含量为 1.339mg/粒)的样品内容物,精密 称取 9 份,每 3 份为一组,每组分别为 1 粒内容物量的 70%、100%和 130%,分别精密加入芍 药苷对照品溶液(Radixastragali)C=0.4920mg/ml)2ml,按“3.2”项下方法操作制备供试液,测定,结果平均回收 率为 99.7%,RSD 为 0.14%(Radixastragali)n=9)。