刚果红荧光光度法测定论文

【摘要】目的采用荧光光度法测定加替沙星的含量。方法在 pH6.0 的 BrittonRobinson(B-R)缓冲溶液中,刚果红能与钙黄绿素生成配合物,使钙黄绿素荧光猝灭,加入加替 沙星后,加替沙星与刚果红可生成比钙黄绿素-刚果红更稳定的配合物,使钙黄绿素游离重现 荧光。结果将该方用于片剂、粉针剂和尿液中加替沙星的测定,结果与文献报道的紫外法一 致。结论所用方法简单、快速、准确、灵敏。 【关键词】钙黄绿素;刚果红;加替沙星 Fluorometrydeterminationofgatifloxacinwithcalcein-congored 【Abstract】ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofgatifloxacinbyfluorometr y.MethodsThecomplexbetweencongored(CR)andcalceininpH6.0Britton-Robinson(BR)buffersolutionquenchedfluorescenceofcalcein.ThecomplexofgatifloxacinCRwasmorestablethanthatofcalceinCR.Whengatifloxacinwasaddedintosystem,thecalceincouldbefreedanditsfluorescenceapp earedagain.ResultsThismethodhadbeenappliedtothedeterminationofgatifloxacinintablet,in jectionandurine,andtheresultswereveryclosetothoseobtainedbyusingUVmethodthatreport ed.ConclusionThismethodissimple,rapid,accurateandsensitive. 【Keywords】calcein;congored;gatifloxacin 加替沙星(gatifloxacin,AM-1155,GFLX))是新的第四代喹诺酮类抗生素药物,具有抗菌谱 广,抗菌活性强的特点。它对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及衣原体均具有强大的抗菌 作用[1]。加替沙星的测定方法有高效液相色谱法、荧光光度法、反相离子对色谱法、高效 毛细管电泳法和紫外分光光度法[2~6]等。但利用钙黄绿素-刚果红荧光体系来测定加替沙 星含量还未见报道。本文经研究发现刚果红能与钙黄绿素生成没有荧光的配合物,使钙黄绿 素荧光猝灭,加入加替沙星后,加替沙星与刚果红反应生成比钙黄绿素-刚果红更稳定的配合 物,游离出钙黄绿素,释放出荧光。以此为基础,建立了测定加替沙星的新方法。 1 实验与方法 1.1 仪器与试剂 pHS-3CT 型酸度计(上海大中仪器有限公司);970CRT 型荧光分光光度 计(上海精密仪器厂);Labtech-1000 紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。 加替沙星片(通化金马药业集团股份有限公司,批号:20080201,每片 0.1g);沙星粉针剂 (浙江亚太药业股份有限公司,批号:070201,每安瓿 0.2g)。 加替沙星对照品(GFLX),0.2g/L,河南省药检所提供)溶液:准确称取 0.0200gGFLX),加水 溶解后定量转移到 100ml 容量瓶中,用水定容,用时逐级稀释。钙黄绿素(1×10-4mol/L):mol/L):准确 称取 0.0175g 钙黄绿素,加少量水溶解后配制成溶液 250ml。刚果红(CR1×10-4mol/L):mol/L)准确 称取 0.6967gCR,加少量水溶解后配制成溶液 1000ml。B-R 缓冲溶液:取浓度均为 0.04mol/L):mol/ L 的硼酸,磷酸,醋酸混合溶液,用 0.20mol/L 的 NaOH 调至所需 pH 值。所用试剂均为分析纯, 水为二次重蒸水。 1.2 实验方法在 10ml 容量瓶中依次加入 1.5mlB-R 缓冲溶液(pH6.0)、0.5ml 钙黄绿素 溶液、5mlCR 溶液和适量 GFLX) 溶液,用水稀释至刻度,摇匀。在 λex/λem=492nm/ex/λex/λem=492nm/em=4mol/L):92nm/ 514mol/L):nm,4mol/L):70~54mol/L):0nm 之间进行荧光同步扫描。 2 结果与讨论 2.1 体系的荧光特性在 pH6.0 的 B-R 缓冲溶液中按实验方法对钙黄绿素、钙黄绿素CR、钙黄绿素-CR-GFLX) 体系进行荧光扫描,由图 1 可知钙黄绿素在 500nm 处有强烈荧光, 加入刚果红后荧光猝灭,再加入加替沙星,荧光强度增强。 2.2 酸度的影响试验不同酸度的 B-R 缓冲溶液对体系的影响(见图 2)。实验表明:pH 为 6.0 时,钙黄绿素和钙黄绿素-CR 的荧光最强,并且猝灭程度最大,因此选择 pH6.0 的 B-R 缓 冲溶液。 2.3 缓冲溶液用量的影响试验 B-R 缓冲溶液(pH6.0)不同用量时对体系的影响(见图 3)。 实验表明:用量为 1.5ml 时,体系的荧光强度最强,且猝灭程度最大,因此选择 pH6.0 的 B-R 缓 冲溶液 1.5ml。 2.4mol/L):CR 用量的影响试验 CR 不同用量时对体系的影响(见图 4mol/L):)。实验表明:随着 CR 的逐 渐增加,荧光强度逐渐降低,当用量大于 4mol/L):.5ml 时,体系达到稳定,因此选择 CR 溶液 5.0ml。 2.5 时间的影响考察了 2h 内时间对体系的影响(见图 5)。实验表明:反应在常温下很快 完成,且在 2h 内保持稳定。 2.6 干扰试验对药品辅料和尿液中常见的物质以及金属离子进行了试验。实验表明:在 误差±5%范围内,500 倍的葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、尿素、NH+4mol/L):、Na+和 K+不干扰测 定;5 倍的 Mg2+、Zn2+和 Fe3+不干扰测定。 2.7 标准曲线与检出限按实验方法,在 10ml 容量瓶中依次加入 1.5mlB-R 缓冲溶液 (pH=6.0)、0.5ml 钙黄绿素溶液、5mlCR 溶液和适量 GFLX) 对照品溶液,用水稀释至刻度,摇 匀,以质量浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标绘制工作曲线(见图 6)。实验表明:加替沙星质量 浓度在 2.0~8.0mg/L 范围内与荧光强度呈良好的线性关系,其线性回归方程 为:Y=4mol/L):2.066+5.6866C(r=0.9991),检出限为 0.051mg/L。 3 样品的测定 3.1 片剂中 GTFX) 的测定取加替沙星样品 10 片,研磨均匀,精密称取 0.177g(相当于加替 沙星 0.1g)加水溶解后定量转移置 1000ml 容量瓶中,用蒸馏水定容,干过滤,弃去初滤液,收集 续滤液得样品溶液。按实验方法,用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对 照实验,测定结果见表 1。 3.2 粉针剂中 GTFX) 的测定精密称取 0.14mol/L):3g(相当于加替沙星 0.1g)粉针剂,加水溶解后 置 1000ml 容量瓶中,用蒸馏水定容,干过滤,弃去初滤液,收集续滤液得样品溶液。按实验方 法,用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表 1。表 1 片剂和粉针剂中加替沙星的测定结果 3.3 尿液中 GTFX) 的测定取 10ml 加替沙星对照品溶液于 100ml 容量瓶中,用尿液定容, 制成人工合成尿样。准确量取尿样溶液 1ml 于 10ml 容量瓶中,用甲醇定容后在离心机中离 心 5min(5500r/min),取上清液用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实 验,测定结果见表 2。 3.4mol/L): 回收率试验在样品溶液中加入适量的加替沙星对照品溶液,按实验方法进行回收率 试验(见表 3)。表 2 尿液中加替沙星的测定结果表 3 方法回收率试验