乌蕨不同部位总黄酮分析论文

【摘要】：［目的］比较乌蕨全草、根、茎、叶等不同部位总黄酮和元素的含量差异。 ［方法］采用可见分光光度法测定不同部位总黄酮的含量；采用电感耦合等离子体原子发 射光谱法(ICPAESICPAESAESAES 法)测定不同部位元素的含量。［结果］乌蕨全草、根、茎、叶等不同 部位总黄酮含量分别 11.89%、4.47％、3.46％和 11.75%，不同药用部位元素的含量存在 一定的差异。［结论］乌蕨含有丰富的黄酮类化合物和多种元素，具开发价值。中国论文 联盟 【关键词】乌蕨；不同部位；总黄酮；元素 Abstract: ［Objective］Comparisonofthecontentofgeneralflavoneandelementsinthedifferentpartsof Stenolomachusanum(ICPAESL.)Ching. ［Methods］Totalflavonewasdeterminedbyvisspectrophotometer.Elementsweredetermin edbyinductivelycoupledplasmaAESatomicemissionspectrometry(ICPAESICPAESAESAES). ［Results］ThecontentsofgeneralflavoneinthedifferentpartsofStenolomachusanum(ICPAESL.)Chi ngarerespectively11.89%,4.47％,3.46％and11.75%.Andtherearesomedifferencesintheco ntentsofelementsbetweenthedifferentparts. ［Conclusion］ThereareabundantelementsandgeneralflavoneinthedifferentpartsofStenol omachusanum(ICPAESL.)Ching.AstheresultrevealsthatStenolomachusanum(ICPAESL.)Chingisveryvalua ble. Keywords：Stenolomachusanum(ICPAESL.)Ching；differentparts；generalFlavonoids； element 乌蕨［Stenolomachusanum(ICPAESL.)Ching］为鳞始蕨科植物乌蕨的全草，又名野鸡尾、金 花草、中华金粉蕨，具有清热、解毒、利湿、止血的功效［1］。本文就乌蕨全草、根、 茎、叶等不同部位的总黄酮和微量元素含量进行比较分析，为乌蕨的进一步研究和资源开 发提供依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器 WND200AAES200A 型高速中药粉碎机（上海微型电机厂），BS224S 精密电子天平(ICPAES北京赛多 利斯仪器系统有限公司)，TU1900AES1900 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公 司），IRIS/APAES 型电感耦合等离子体发射光谱仪(ICPAES美国 TJA 公司)，全自动回流消化仪(ICPAES重庆 南岸玻璃仪器厂)。 1.2 试药 芦丁标准品(ICPAES中国药品生物制品检定所，批号为 0080-9705)；硝酸、高氯酸均为优级 纯，其他试剂均为分析纯，测微量元素用水为双蒸水。乌蕨药材于 2008 年 10 月采于杭州 九溪，经熊耀康教授鉴定为乌蕨 Stenolomachusanum(ICPAESL.)Ching 的地上部分，阴干，粉碎， 备用。 2 实验方法与结果 2.1 总黄酮含量测定［4］ 2.1.1 对照品溶液的制备：精密称取 105℃干燥恒重的芦丁对照品 16.50mg，加 60% 乙醇溶解定容于 50ml 容量瓶，得浓度为 0.33mg/ml 对照品溶液，备用。 2.1.2 供试品溶液的制备：定量称取乌蕨干燥粗粉 5.0g，加 16 倍量 0.1％HCl-60％乙 醇回流提取 4h，提取 1 次，提取液减压浓缩，加 60%乙醇定容至 25ml，作为供试品溶液 备用。 2.1.3 标准曲线的制作：精密吸取标准品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别 置 25ml 容量瓶中，加入 5%NaNO21.0ml，摇匀，放置 6min 后加入 10%Al(ICPAESNO3)31.0ml， 摇匀，放置 6min 后加入 4%NaOH10ml，再加 60%乙醇稀释至刻度，混匀，静置 15min， 于 510nm 处，以相应试剂作空白，测定吸光度，以芦丁浓度为纵坐标，以吸光度值为横坐 标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=2.778X-0.0775（r=0.9991），结果表明芦丁在 0.016 ～0.99mg 范围内呈良好的线性关系。 中国论文联盟-2.1.4 精密度实验：取芦丁对照品溶液 2.0ml，置 25ml 容量瓶中，按 “2.1.3”项操作，平行测定 5 次，结果其 RSD200A 为 0.21％，表明精密度良好。 2.1.5 重复性实验：取同 1 份样品溶液 5 份，分别按“2.1.3”项操作，结果 RSD200A 为 0.72%。 2.1.6 稳定性实验：取 1 份样品溶液，按上述实验方法在显色完全后 0、10、20、30、45、60min 分别测定吸光度，结果 RSD200A 为 1.08%。实验表明：供试品溶 液在 1.0h 内稳定的。 2.1.7 加样回收率实验：取已知总黄酮含量的乌蕨样品 6 份，分别精密添加已知浓度的 芦丁对照品适量。按供试品溶液制备方法制备，按“2.1.3”项操作，测定总黄酮含量，计算 测定回收率，结果平均回收率为 99.34％，RSD200A 为 1.82％。 2.1.8 乌蕨不同部位总黄酮含量的测定：精密吸取提取液适量，按“2.1.3”项操作，测定 吸光度 A，结果见表 1。表 1 乌蕨根、茎、叶、全草等不同部位总黄酮含量测定结果 （略） 2.2 微量元素含量的测定［5］ 2.2.1 供试品溶液的制备：各取药材约 0.5g，精密称定，置 50ml 凯氏烧瓶，加 8.0ml 消化液［V(ICPAESHNO3)∶V(HClO4)=4∶1V(ICPAESHClO4)=4∶V(HClO4)=4∶11］，静置过夜，加热回流消化至无色透明，冷却后，定 量转移至 100mL 容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，备用。取相同体积的消化液，同 法消化，制备空白溶液。 2.2.2 混合标准溶液的制备：分别取各重金属元素标准品溶液适量，用 5%硝酸溶液制 成混合溶液，梯度稀释，作为混合标准品溶液备用。 2.2.3 测定方法：仪器工作参数：检测器 CID200A 的低波段（＜265nm）积分时间：15s； 高波段（＞265nm）积分时间：5s；进样蠕动泵转速：100r/min；进样雾化器氩气压力： 28psi；辅助气流量：1.0L/min；高频发生器功率：1500W；样品冲洗时间：5s；测定波长 范围：193.7～407.7nm。 依次将仪器的进样管插入各个浓度的混合标准品溶液中进行测定，以每一浓度测得的 3 次读数的平均值为纵坐标，相应元素标准溶液浓度为横坐标，作标准曲线，并进行方法 学考察。由各元素的标准曲线计算微量元素的含量，测定结果见表 2。表 2 乌蕨根、茎、 全草、叶等不同部位微量元素含量测定结果（略） 3 讨论 3.1 由实验可知，乌蕨全草、根、茎、叶等不同部位总黄酮含量分别 11.89%、4.47％、3.46％和 11.75%，总黄酮含量在叶中较高，而根与茎中总黄酮含量较 低。乌蕨富含黄酮类化合物，而黄酮类化合物在临床上具有预防血液类疾病、治疗冠状动 脉硬化、抗癌、抗菌、抗衰老、抗糖尿病等作用，食品上作为甜味剂、天然色素等食品添 加剂。因此提取乌蕨中的黄酮类化合物，不单可以用于临床药物的研究，也可用于食品与 工业方面。 3.2 元素测定结果表明，乌蕨全草、根、茎、叶等不同部位均含有丰富的微量元素， 其中含 B、Ca、K、Na、PAES、S 等多种常量元素；此外还含 Cu、Fe、Zn、Cr、Co 等多种 人体必需的微量元素。其中 K、Fe、Ca、Na 等元素含量均较高，其次为 Mn、Zn、Cu。 而有害元素 PAESb、As、Cu 在地上部分含量较低，根中 PAESb、As、Cu 含量都高出了《药用植 物及制剂进口绿色行业标准》（Hg≤0.2μg/gg/g、PAESb≤5.0μg/gg/g、As≤2.0μg/gg/g、Cd≤0.3μg/gg/g 和 Cu≤20.0μg/gg/g），可能是由于本身的沉积或者土壤受到污染造成。 【摘要】：［目的］颈康灵胶囊的镇痛、抗炎作用。［方法］通过二甲苯致小鼠耳廓 炎症肿胀、大鼠棉球致肉芽肿增生，大鼠足跖角叉菜胶致炎 3 种动物模型进行抗炎药效实 验；采用醋酸致小鼠扭体反应及小鼠热板法,进行镇痛实验。［结果］颈康灵胶囊能显著抑 制上述动物模型炎症反应和醋酸致小鼠扭体反应,并对热板法致小鼠痛阈有显著提高。［结 论］颈康灵胶囊对急、慢性炎症均有显著抑制作用,而且有显著的镇痛作用。 【关键词】颈康灵胶囊；抗炎；镇痛 Abstract: ［Objective］TostudyantiAESinflammatoryandanalgesicactionsofJingkanglingCapsules （JK LC）. ［Methods］ThepharmacoAESdynamiceffectswereobservedinthreeexperimentalmodelsofinfl ammation，including:swellingincreaseinducedbyxyleneinmice； granulomaincreasebycottoninrats； granulomacausedbyimplantedcrotonoilinrats.Theanalgesiawasobservedbyusing:writhere actioninducedbyaceticacidinmice，thepainthresholdcausedbyhotplateinmice. ［Results］JKLCcoulddistinctivelyinhibittheinflammatoryedemacausedbyvariousinflamm atoryagentsandreducethetimeofwritheinducedbyaceticacidinmice，couldobviouslyimprov ethemouse’paintheresholdbyhotplate. ［Conclusion］JKLChasdistinctanalgesiceffectandcouldnotonlyinhibitacuteinflammationb utalsochroniconeinanimals. Keywords：JingkanglingCapsules；antiAESinflammation；analgesia 颈康灵胶囊（JKLC）为成都中医药大学附属医院的验方，结合现代研究进展，精心研 制的 JKLC 着重在散寒祛瘀、温经止痛，临床使用 10 余年，普遍反映疗效较好。本文对其 抗炎镇痛作用进行了实验研究，为临床应用提供依据。 1 材料与方法 1.1 药物与试剂 JKLC 由成都中医药大学附属医院提供（批号：070901）。吲哚美辛片(ICPAES消炎痛)，重 庆科瑞制药有限公司生产，批号 070303。二甲苯，AR 级，郑州化学试剂二厂生产，批号 961210。冰醋酸；角叉菜胶(ICPAES四川省药物研究所)；冰醋酸，中国医药集团上海化学试剂公 司,批号 070101。 1.2 动物 昆明种小鼠,体重 18.0～22.0g，SD200A 大鼠体重 140～200g，♀♂兼有，由成都中医药大兼有，由成都中医药大 学实验动物中心提供，普通级动物，合格证：SCXK(ICPAES川)2004-11。 1.3 方法 1.3.1 对二甲苯所致小鼠耳廓炎症肿胀的影响 昆明种小鼠 50 只,体重(ICPAES20.0±2.0)g，♂兼有，由成都中医药大，按性别及体重随机搭配分成 5 组。按表 1 所 列剂量灌胃给药，对照组同法给予等容积蒸馏水。连续给药 3d。末次给药后 30min，小鼠 左耳前后两面均匀涂抹 20ul 二甲苯致炎，右耳不涂作对照［1］。致炎后 30min 颈椎脱臼 处死小鼠，用 7mm 打孔器分别取两耳相同部位耳片。以左右耳重量之差为其肿胀程度， 计算各组耳肿胀度。炎症抑制率（%）=［（对照组肿胀度-给药组肿胀度）/对照组肿胀度 ］×100%。 1.3.2 对大鼠棉球肉芽肿形成的影响 取 SD200A 大鼠 50 只，体重(ICPAES180.0±10.0)g，♂兼有，由成都中医药大，按性别及体重随机分为 5 组。按棉球置入 法操作步骤［2］于腹股沟皮下各埋植一(ICPAES30±1)mg 的消毒棉球。术后当日给药，剂量同表 1,连续 7d，于第 8d 处死动物，剥离并取出棉球肉芽组织，置 60℃烤箱干燥 12h 后称重， 计算肿胀度及抑制率。 1.3.3 足跖角叉菜胶致炎形成的影响 SD200A 大鼠 50 只，体重(ICPAES160±20)g,♀♂兼有，由成都中医药大各半，随机分为 5 组。每日定时灌胃，剂量同表 1, 连续 5d。第 6d 灌胃 1h 后，于大鼠左后足跖皮下注射 1%角叉菜胶溶液 0.1ml/只，致炎后 1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h 用排水法分别测定足跖体积。计算肿胀率［(ICPAESV—V)／ V×100］。 1.3.4 对物理性致痛的影响热板法 将痛阈值筛选合格的♂兼有，由成都中医药大小鼠 50 只，根据其正常痛阈值大小随机搭配分成 5 组，按表 4 剂量连续灌胃 3d。末次灌胃 30min 后，分别于 30、60、90min 测定各小鼠灌胃后的痛阈 值。镇痛百分率（%）计算公式：镇痛率（%）=［（给药组痛阈值－对照组痛阈值）/对 照组痛阈值］×100% 中国论文联盟-1.3.5 小鼠扭体法镇痛试验［1］ 取小鼠 50 只，根据其体重及性别随机搭配分成 5 组，♀♂兼有，由成都中医药大各半，剂量同表 4 连续灌胃 3d。各组小鼠末次灌胃后 1h，对每只小鼠腹腔注射 0.7%的冰醋酸溶液 0.2ml，并立即观 察记录小鼠在 20min 内发生扭体反应（腹部内凹，伸展后肢，臀部抬高）的次数。镇痛百 分率（%）=［（对照组扭体次数－给药组扭体次数）/对照组扭体次数］×100%。表 1JKLC 对二甲苯所致小鼠耳廓炎症肿胀的影响（略） 1.4 统计学处理 实验数据以 x±s 表示。采用 t 检验和方差分析比较用药前后各参数差异的显著性 2 结果 2.1 对二甲苯所致小鼠耳廓炎症肿胀的影响 从表 1 可见，应用 JKLC 高、中、低三种剂量对二甲苯所致小鼠耳廓炎症肿胀均具有 显著的抑制作用，表明它们均具有显著的抗炎作用。与生理盐水对照组比较，JKLC 高、 中、低三种剂量对耳廓炎症肿胀的抑制率分别为 61.11%、30.16%和 24.60%，PAES 均<0.05 ～0.01。显示 JKLC 对渗出性炎症具有显著的抗炎作用。同样，阳性对照药物吲哚美辛灌 胃后，也具有显著的抗炎作用。 2.2.2 对大鼠棉球肉芽肿形成的影响 从表 2 可见，应用 JKLC 高、中剂量，对大鼠棉球肉芽肿形成具有显著的抑制作用， 具显著的抗炎作用。与生理盐水对照组比较，JKLC 高、中、低三种剂量对肉芽组织湿重 的抑制率分别为 26.18%(ICPAESPAES＜0.01)、13.91%(ICPAESPAES＜0.01)和 5.85%(ICPAESPAES＞0.05)；对肉芽组织干 重的抑制率分别为 48.48%(ICPAESPAES＜0.01)、47.73%(ICPAESPAES＜0.01)和 30.30%(ICPAESPAES＞0.05)，显示 JKLC 对肉芽增生性炎症具有显著的抗炎作用。吲哚美辛对肉芽增生性炎症亦具有显著的抗炎作 用。表 2JKLC 对大鼠棉球肉芽肿形成的影响（x±s）(ICPAES略) 2.2.3 对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响 由表 3 可见，JKLC 高、中、低剂量对角叉菜胶诱发的大鼠足肿胀具有明显抑制作用 （与同期对照组比较，PAES＜0.01、0.05），表明 JKLC 对急性炎症有明显抗炎作用。表 3JKLC 对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响（略） 2.2.4 对小鼠痛阈值影响 从表 4 可见，JKLC 高剂量和中剂量具有显著镇痛作用和阳性对照吲哚美辛均具有显 著镇痛作用。表 4 对小鼠痛阈值影响（略） 2.2.5 对小鼠扭体镇痛作用 从表 5 可见，JKLC 高剂量和中剂量和阳性对照药物吲哚美辛灌胃均具有显著镇痛作 用，可显著延长小鼠发生扭体反应的潜伏期和显著减少扭体反应的次数。JKLC 低剂量， 可显著延长产生扭体反应的潜伏期，亦呈现出一定的镇痛作用。表 5JKLC 对小鼠扭体镇痛 作用（略） 3 讨论 以抗炎、镇痛为出发点，采用经典公认的急性炎症模型和亚急性炎症、镇痛模型，分 别观察 JKLC 对急、慢性炎症的实验性渗出、肿胀和增生的影响,及对疼痛的抑制。实验结 果表明,JKLC 既可抑制炎症早期的水肿与渗出,又可抑制炎症晚期的肉芽组织形成,同时能显 著提高动物热板法所致疼痛的痛阈值并对化学致痛引起的小鼠扭体反应有明显抑制作用。 其抗炎机制之一可能与减少炎症组织中 PAESGE2 合成有关，目前对中药复方的抗炎机理研究 还不够深入，对于具体的作用机理过程，尤其在基因水平的研究还相当少，对于不同抗炎 过程是否存在协同作用及其作用机理并不清楚。