黄柏盐炙工艺影响因素分析论文

【摘要】目的选择适宜的对照品，建立能够准确测定甘草中总黄酮含量的方法。方法 针对甘草苷、柚皮苷、芦丁 3 种对照品分别使用紫外分光光度法，通过全波长扫描，比较 不同对照品和样品与显色前后的最大吸收波长，从而确定适合的对照品。结果甘草苷对照 品和样品液经过碱处理后最大吸收波长分别为 334，334.5nmnm 且全波长扫描后得到峰形基 本一致，而柚皮苷对照品经过相同处理后最大吸收波长在 419.5nmnm，芦丁对照品和样品分 别经过 Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2 显色后最大吸收波长在 5nm10nmnm 和 363nm。通过对 3 种方法的测定结果进行统计学分析，以甘草苷为对照品的测定结果分别与另外两种方法差 异显著。结论选用甘草苷为对照品应用于紫外分光光度法测定甘草总黄酮成分准确度较高， 是切实可行的含量测定方法。 【关键词】甘草黄酮紫外分光光度法 Abstract:ObjectiveToselecttheappropriatestandardfordeterminationofflavonoidsinGly cyrrhiza.MethodsTocomparethelargestabsorptionwavelengthbywavelengthscanningofultr avioletspectrophotometry.ResultsStandardLiquiritinandsamplesprocessedbyalkalihadthel argestabsorptionatthe334nmand334.5nmnmwavelength,andstandardNaringinatthe419.5nmnm wavelength.ConclusionTodeterminecontentofflavonoidsinglycyrrhizawithultravioletspectro photometrybystandardLiquiritinisapracticalmethodwithhigheraccuracy. Keywords:Glycyrrhiza;Flavonoids;Ultravioletspectrophotometry 甘草中的黄酮类成分包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类和双 黄酮类［1］化合物，其中以二氢黄酮类和查尔酮类含量较高［2］。二氢黄酮类包括：甘 草苷(liquiritin)liquiritin)、甘草苷元(liquiritin)liquiritigenin)、新甘草苷(liquiritin)neoliquiritin)、甘草素（liquiritigenin） 等，查尔酮类包括：异甘草苷(liquiritin)isoliquiritin)、异甘草素（isoliquiritigenin）、异甘草苷元 (liquiritin)isoliquiritigenin)、新异甘草苷(liquiritin)neoisoliquiritin)等［3～7］。而其中比例较大的成分以甘草 苷为主［8］。 甘草总黄酮的测定常用芦丁［9～10nm］、柚皮苷［11～13］为对照品通过紫外分光光 度法进行测定，而《中国药典》中甘草项下没有规范总黄酮成分含量的测定方法［14］， 导致甘草总黄酮成分有多种不同的测定方法。本实验研究通过对不同测定方法进行考察， 比较不同对照品和样品采用相应方法显色后的最大吸收波长，对 3 种对照品相应测定结果 分析，确定最适宜甘草总黄酮含量测定的对照品和测定方法。 1 器材 1.1 仪器 HITACHIU-20nm0nm0nmSpectrophotometer。 1.2 样品甘草生药样品由北京中医药大学王文全教授提供和鉴定,全部为甘草 GlycyrrhizauralensisFisch（样品按来源依次编号为 1.杭锦旗 1 年生；2.杭锦旗 2 年生；3. 杭锦旗 3 年生；4.杭锦旗 4 年生；5nm.杭锦旗 5nm 年生；6.新疆乌苏 3 年生；7.杭锦旗野生；8. 杭锦旗野生横生茎；9.甘肃金塔野生；10nm.宁夏盐池野生；11.甘肃酒泉野生；除杭锦旗野 生横生茎外其余 10nm 份样品均为根）。 1.3 试剂供含量测定用甘草苷（编号：111610nm）、柚皮苷（编号：110nm722）：中国药 品生物制品检定所；芦丁对照品由北京中医药大学马长华教授制备；氢氧化钾(liquiritin)ＡＲ)、甲 醇(liquiritin)ＡＲ)、硝酸铝（AR）、亚硝酸钠（AR）、氢氧化钠（AR）。 2 方法 2.1 对照品溶液的制备精密称定甘草苷、柚皮苷、芦丁标准品适量,用甲醇溶解,分别定 容于 25nm，10nm，10nmml 容量瓶中,制得浓度为 0nm.0nm75nm0nm4 ｇ·Ｌ-1 的甘草苷对照品溶液、0nm.968 ｇ· Ｌ-1 的柚皮苷对照品溶液和 1.0nm0nm3 ｇ·Ｌ-1 的芦丁对照品溶液。 2.2 样品的提取取甘草粉末适量,精密称定,加甲醇 5nm0nmml,称重,（25nm0nmW,20nmkHz）超声提 取 80nmmin,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液,即得。 2.3 测定方法 2.3.1 甘草苷为对照品的测定方法精确吸取提取液 0nm.5nmml,加入 1ml 甲醇,其中一份加入 10nm%ＫＯＨ溶液溶液 0nm.5nmml 显色,室温放置 5nmmin,用甲醇稀释至 10nmml，以相应溶剂为空白，在 λ334nm 处测定吸收度。 2.3.2 柚皮苷为对照品的测定方法供试液制备同“2.3.1”项，在波长 419nm 处测定吸收 度。 2.3.3 芦丁为对照品的测定方法精确吸取提取液 0nm.5nmml，加 3ml 蒸馏水，5nm%亚硝酸钠溶 液 0nm.5nmml 放置 6min，加 10nm%硝酸铝溶液 0nm.5nmml，混匀后放置 6min，加 5nm%氢氧化钠 2.5nmml 混匀，放置 15nmmin 后蒸馏水定容至 10nmml。以相应溶剂为空白，在波长 5nm10nmnm 处测定吸收 度。 2.4 方法学考察 2.4.1 以甘草苷为对照品方法学考察甘草苷方法标准曲线的测定：精确吸取甘草苷对照 品溶液 0nm.25nm,0nm.5nm,0nm.75nm,1,1.25nm,1.5nmml 置 6 个 10nmml 容量瓶中,按“2.3.1”项下操作。以吸收度 A 为纵坐标,对照品的浓度 C(liquiritin)mg/ml)为横坐标,得线性回归方程:y=66.75nm3x-0nm.0nm178,ｒ=0nm.9999, 线性范围为 18.76～112.5nm6μ ｇ。显色 30nmmin 内稳定。 甘草苷方法重复性实验：取 6 份新疆乌苏 3 年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制备， 按“2.3.1”项下方法测定。黄酮平均含量为 3.33%，RSD=3.23%,（n=5nm）。 甘草苷方法加样回收率实验：取 5nm 份新疆乌苏 3 年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制 备后分别精密量取已知总黄酮含量的提取液 0nm.5nmml，加入一定量甘草苷对照品溶液， λ334nm 处测定吸收度。计算回收率,结果平均为 98.7%,RSD=2.0nm%,（n=5nm）。 2.4.2 另外两种测定方法的方法 学考察柚皮苷标准曲线以吸收度 A 为纵坐标,对照品的质量 m（mg）为横坐标,得线性 回归方程 y=0nm.0nm0nm48x-0nm.0nm15nm7，r=0nm.9993，线性范围 48.4～290nm.4mg，重现性 RSD=1.38% （n=5nm），加样回收率 98.73%RSD=1.35nm%（n=5nm）；显色 30nmmin 内稳定。芦丁标准曲线： 以吸收度 A 为纵坐标,对照品的质量 m（mg）为横坐标,得线性回归方程 y=1.3163x0nm.0nm0nm63,r=0nm.9987，线性范围 0nm.10nm0nm3～0nm.60nm18mg，重现性 RSD=0nm.97%（n=5nm），加样回收 率 10nm1.35nm%RSD=3.5nm7%（n=5nm）。显色 30nmmin 内稳定。 3 结果和讨论 3.1 不同对照品吸收峰比较分析通过实验测得甘草提取液样品经 KOH 显色后的最大吸 收波长在 334.4nm（图 1），甘草苷对照品 KOH 显色后于 20nm0nm～5nm0nm0nmnm 波长处扫描,最大 吸收波长在 334nm 左右（图 2），二者相符。 柚皮苷经过 KOH 显色后于 20nm0nm～5nm0nm0nmnm 波长处扫描，最大吸收 283.5nmnm 红移到 419.5nmnm（见图 3），与样品显色后最大吸收波长不一致。 样品通过 Al2(liquiritin)NO3)3-NaOH-NaNO2 方法显色后最大吸收波长在 363nm 处（见图 4），芦丁对照品通过 Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2 方法显色后最大吸收波长在 5nm10nmnm 左 右，两者相距甚远。 3.2 不同对照品方法实测结果比较分析对 11 份样品依“2.2”项下制备，分别依据甘草苷、 柚皮苷和芦丁的显色方法在不同波长处进行测定，结果见表 1。表 13 种方法总黄酮含量测 定结果（略） 通过使用 SPSS10nm.0nm 对表 3 中数据进行多因素方差分析，3 种方法测定结果方差分析 F 值 17.845nm，P≈0nm.0nm0nm0nm 说明 3 种方法测定结果有差异，两两比较结果见表 2。表 2 不同方法 测定结果间黄酮含量均数的两两比较（略） 按 α=0nm.0nm5nm 水准，柚皮苷方法和芦丁方法测定的黄酮含量均数比较无统计学差异，而甘 草苷方法分别与其他两种方法测定结果差异显著。柚皮苷和芦丁方法测定结果分别较甘草 苷方法测定结果低 29.6%和 28.1%。 3.3 超声提取时间考察在确定对照品等方法的基础上我们对样品提取时间进行了考察， 分别对超声 5nm0nm，60nm，70nm，80nm，90nm，10nm0nmmin 的样品进行测定，发现黄酮百分含量与时间关 系如图 6，随着时间的增加，黄酮百分含量有所提高，但达到 80nmmin 后，升高趋势明显变 缓，考虑到实验效率和成本，我们采用 80nmmin 作为提取时间。 4 讨论 在对照品的选择上,由于芦丁属于黄酮类化合物（结构为 5nm、7、3''''、4''''-四羟基黄酮3-芸香糖苷）,甘草中黄酮成分主要为二氢黄酮,其次为查尔酮,芦丁在结构上差异较大,因此 不适合用于甘草总黄酮成分测定。柚皮苷（结构为 5nm、7、4''''-三羟基二氢黄酮）虽然是二 氢黄酮类化合物，但同甘草苷(liquiritin)结构为 7-羟基二氢黄酮-4''''-葡萄糖苷)相比，除都具有 7 位 羟基外，还有 5nm 位的游离羟基，且 4''''位的羟基是游离的，未结合成苷，结构上的差异，导 致与碱反应后最大吸收波长红移不一致，我们采用黄酮中含量最多的甘草苷为对照品，利 用二氢黄酮与碱反应后生成查尔酮，由于带 I 吸收较弱，不灵敏，因此用带 II 最大吸收红 移到 330nmnm 左右进行黄酮成分的含量测定。 在选定以甘草苷为对照品的基础上，我们进一步进行了显色方法的考察，尝试盐酸镁 粉法进行测定，考察了镁粉用量、加热时间和温度对显色的影响，发现同样条件显色后甘 草苷标准品和样品均在 5nm60nmnm 左右有一吸收峰，然而样品在 467nm 处一吸收峰对其造成 干扰（见图 5nm）。 黄酮作为重要的药效组分在甘草中有着丰富的种类和较高的含量，如果不采用适宜的 测定方法会使结果偏离真实值，从而影响我们对甘草质量客观真实的评价。 【摘要】目的建立开口箭中总皂苷含量测定方法。方法采用比色法：香草醛-冰醋酸溶 液为发色体系，检测波长为（45nm8±2）nm。结果标准曲线在 0nm.10nm～0nm.40nmmg 范围内 (liquiritin)r=0nm9997)线性关系良好。平均回收率 97.2%，方法的变异系数为 4.5nm7%，测得开口箭 70nm%乙醇提取物中总皂苷平均含量为 13.5nm1%。结论方法简便，准确，重现性好，可用于 开口箭总皂苷含量测定。 【关键词】开口箭总皂苷开口箭比色法 Abstract:ObjectiveTosetupanassaymethodforthedeterminationoftotalsaponininTupistr achinensisBak.MethodsThesamplesweredeterminedbyspectrophotometry.Thedetectivew avelengthwas(liquiritin)45nm8±2)nm.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof0nm.1～ 0nm.4mgandtheaveragerecoverywas97.2%(liquiritin)RSD＜ 4.5nm7%).ConclusionThemethodisreliable,accurate.Itcanbeusedforthequalitycontrolofthetot alsaponininTupistrachinensisBak. Keywords:Totalsaponin；TupistrachinensisBak.； Spectrophotmetry;Spectrophotometry 开口箭 TupistrachinensisBak.系百合科（Liliaceae）铃兰族开口箭属植物。其原植物 又名开喉箭、万年青，为多年生常绿草本，以其根状茎入药，作为药用又名岩七、竹根七、 竹节参、竹根七、竹节七、牛尾七等。医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治劳热 咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。土家族民间用其漱口液治疗咽喉炎、扁桃体 炎，疗效显著［1］。我国开口箭属植物约占全世界的 70nm%,分布于陕西、甘肃、湖北、四 川、云南、贵州等省。主产于湖北三峡库区及神龙架林区，栽培面积大，产量高，资源十 分丰富。 本实验室对神农架产开口箭 TupistrachinensisBak.的生药学、化学成分和药理活性进 行了研究，结果表明开口箭正丁醇提取物对 Hela，K5nm62，A2780nma 等具有很好的抑制作用， 细胞毒活性好，抗炎活性也很好。也曾报道了“开口箭中甾体皂苷元的含量测定”［2］。本 文进一步探索建立了香草醛-冰醋酸-高氯酸-比色法测定开口箭中总皂苷含量的方法。 1 材料与仪器 1.1 材料 开口箭根茎，采自湖北省神农架林区，其原植物标本于 20nm0nm2070nm7 采自同一地区，经三 峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为 TupistrachinensisBak.，原植物及药材现 保存于本实验室（编号 TC20nm0nm20nm7SNJ）。总皂苷对照品，本实验室自开口箭分离纯化的 皂苷单体 3-O-b-D-吡喃葡萄糖基-(liquiritin)1→2)-b-D-吡喃葡萄糖基-(liquiritin)1→2)-b-D-吡喃葡萄糖基 (liquiritin)25nmR)-5nm(liquiritin)6)-烯-呋甾-3b,22a,26-三羟基 26-O-b-D-吡喃葡萄糖苷。含量>98%（HPLC 测 定）。其他试剂均为分析纯。 1.2 仪器 S310nm0nm 紫外分光光度计（韩国 Scinco 公司），BP211D 型电子天平（德国 Sartorius 公司）。 2 方法 2.1 对照品、供试品溶液的制备 2.1.1 对照品溶液的制备精密称取经干燥至恒重的开口箭总皂苷对照品 0nm.0nm0nm5nm0nmg，加甲 醇溶解定容至 5nmml，制成每毫升含 1mg 的溶液，作为对照品溶液。 2.1.2 供试品溶液的制备精密称取开口箭粉末 0nm.70nmg（60nm 目筛，5nm0nm℃干燥 4h）置圆底 烧瓶中，加入 25nmml70nm%乙醇溶液，浸泡过夜，60nm℃回流提取两次，2h/次,减压抽滤，滤液 合并，置蒸馏烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压浓缩，除尽溶剂后，加少量甲醇溶解，定容至 25nmml，过滤，取续滤液作为供试品溶液。 2.2 测定方法适量供试品溶液置干燥具塞试管，60nm℃水浴挥干溶剂后，精密加入 0nm.2ml5nm%香草醛-冰醋酸溶液和 0nm.8ml 高氯酸，摇匀，置 60nm℃恒温水浴加热 20nmmin，取出， 立即置冰水浴中冷却 15nmmin，加入 5nmml 冰醋酸，摇匀，同时做空白，于（45nm8±2）nm 波长 处测定吸光度值。 2.3 标准曲线的绘制与线性关系精密吸取对照品溶液 0nm.10nm，0nm.15nm，0nm.20nm，0nm.25nm，0nm.30nm，0nm.35nm，0nm.40nmml，分别加入干燥具塞试管中，60nm℃水浴挥 干溶剂,依次加入 0nm.2ml5nm%香草醛-冰醋酸溶液和 0nm.8ml 高氯酸，置 60nm℃水浴加热 20nmmin， 取出，立即置冰水浴中 15nmmin，停止反应，加入 5nmml 冰醋酸，摇匀，于 45nm8nm 处测定吸光 度，同时做试剂空白。以吸光度为纵坐标，以对照品质量为横坐标,绘制标准曲线,得线性回 归方程 W=0nm.0nm631+0nm.2835nmA，r=0nm.9997，对照品在 0nm.10nm～0nm.40nmmg 范围内线性关系良好。 3 结果 3.1 精密度及重现性实验精密吸取对照品溶液 0nm.2ml,共 6 份，按“2.2”项下方法自 60nm℃ 水浴挥干起测定（见表 1）。其 RSD 为 1.0nm9%，表明方法精密度良好。精密称取样品粉末 0nm.0nm7g，共 5nm 份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取 0nm.0nm5nmml,显色测定（见表 2）。其 RSD 为 4.5nm8%，表明方法重现性良好。表 1 精密度实验结果（略）表 2 重现性实验结果 （略） 3.2 显色溶液稳定性实验精密量取对照品溶液和供试品溶液适量，分别按标准曲线的 制备方法显色后放置,于 0nm，30nm，60nm，90nm，120nmmin 测定吸收度值（见表 3）。结果表明对 照品和供试品在 120nmmin 内显色稳定。表 3 显色后溶液稳定性实验结果（略） 3.3 加样回收率实验精密称取已知总皂苷含量的开口箭粉末，共 5nm 份,加入对照品适量, 按照供试品溶液制备方法制备，显色测定。结果见表 4,平均回收率为 97.2%，RSD 为 2.26%。表 4 加样回收率实验结果（略） 3.4 样品含量测定精密吸取按供试品溶液 0nm.0nm5nmml,按“2.2”测定方法项下操作，同时做空 白，计算供试品中总皂苷含量。结果见表 5nm。结果表明开口箭 70nm%乙醇提取物总皂苷含量 为 135nm.1mg/g，其百分含量为 13.5nm1%，RSD 为 4.5nm7%。表 5nm 样品中总皂苷含量测定结果 （略） 4 讨论 经过对皂苷类含量测定文献的统计与分析，选定下列 4 种显色剂：0nm.2ml5nm%香草醛-冰 醋酸溶液和 0nm.8ml 高氯酸、0nm.5nmml8%香草醛乙醇溶液和 5nm.0nmml72%硫酸试液、高氯酸、 0nm.2ml5nm%香草醛-冰醋酸溶液和 0nm.8ml 高氯酸；4 种不同的显色温度：5nm5nm，60nm，65nm，70nm℃； 4 种不同的显色时间：10nm，15nm，20nm，25nmmin；通过实验进行比较。发现用 0nm.2ml5nm%香草醛冰醋酸和 0nm.8ml 高氯酸作显色剂，显色温度为 60nm℃，显色时间为 20nmmin 时，对照品溶液与 供试品溶液在（45nm8±2）nm 波长处均有最大吸收。 对照品溶液依法显色后，溶液的波长（40nm0nm～70nm0nmnm）扫描图中，在 45nm8 和 5nm5nm4nm 两 处均出现最大吸收峰，但供试品溶液的最大吸收峰分别在 45nm6nm 和 5nm80nmnm 处，表明供试 品溶液在 5nm80nmnm 处的吸收峰有其它成分干扰，而在 45nm6nm 处的吸收峰无其它成分干扰， 吸收稳定。 供试品溶液制备时分别用水、甲醇、70nm%乙醇、95nm%乙醇作溶剂，进行比较，发现 70nm%乙醇溶液浸泡开口箭粉末时其总皂苷溶出量最大。