肝愈胶囊的质量标准研究论文

【摘要】目的建立控制肝愈胶囊的质量标准。方法对肝愈胶囊中主要成分丹参、栀子、 黄柏、黄芪、五味子进行了薄层色谱鉴别；采用高效液相色谱法测定黄芩苷的含量。结果 薄层色谱法可以对该制剂中的丹参、栀子、黄柏、黄芪、五味子作出准确鉴别；黄芩苷的 线性范围为 0.12～0.58μgμgg，r=0.9997，平均加样回收率为 99.06，RSD 为 1.40(n=5)n=5)。结 论方法灵敏、简便、重现性好，可作为该制剂的质量标准。 【关键词】肝愈胶囊黄芩苷薄层色谱高效液相色谱 Abstract:ObjectiveToestablishthequalitystandardforGanyuCapsule.MethodsRadixSal viaeMiltiorrhiae,FructusGardeniae,CortexPhellodendri,RadixAstragaliandFructusSchisan draewereidentifiedbyTLC.BaicalinwasdeterminedbyHPLC.ResultsTLCspotsdevelopedwer efairlyclear,andtheblanktestshowednointerference.Baicalinshowedagoodlinearrelationshi pintheconcentrationrangeof0.1168μg～ 0.58μg40μgg，andtheaveragerecoverywasupto99.06%,RSDwas1.4%.ConclusionThemethod isaccurate,reproducibleandsimple.Itcanbeusedasthequalitycontrolofthispreparation. Keywords:GanyuCapsule;Baicalin;TLC;HPLC 肝愈胶囊由黄芩、丹参、栀子、黄柏、黄芪、五味子等中药组成，具有清热解毒、益 气活血的功效。主治气阴两虚型肝炎。为控制本品的内在质量，本实验采用 TLC，HPLC 等方法对其进行质量标准研究。 1 仪器与试药 Waters600E24872487248μg7 型高效液相色谱仪﹙美国﹚；Millennium 色谱工作站数据处理系统 ﹙美国﹚；BP211D 电子天平﹙德国﹚。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分 析纯。黄芩苷﹙71524879908μg﹚供含量测定用，纯度 99.02%﹚、丹参酮ⅡⅡ А﹙076624879903﹚、 栀子苷﹙0749248798μg06﹚、盐酸小檗碱﹙713248798μg13﹚、黄芪甲苷﹙078μg1248798μg06﹚、五味子乙 素﹙076524879706﹚，对照品均购自中国药品生物制品检定所。肝愈胶囊 3 批样品： 040105，040108μg，040111﹙自制﹚。硅胶 G﹙青岛海洋化工厂﹚。 2 方法与结果 2.1 薄层鉴别 2.1.1 丹参的鉴别［1］ 取本品内容物 3g，研细，加乙醚 20ml，超声处理 20min，滤过，滤液挥干，残渣加 醋酸乙酯 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材粗粉 1g 和按处方量从中除去丹 参药材的阴性对照品粗粉 4g，分别同法制成对照药材溶液和阴性对照液。再取丹参酮ⅡⅡ A 对照品，加醋酸乙酯制成每毫升含 0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法实验 ［1］，吸取上述 4 种溶液各 6μgl,分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以苯-醋酸乙酯﹙19∶1﹚1﹚ 为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点，而阴性对照色谱在相应的位置上无此斑点。见图 1。 2.1.2 栀子的鉴别［1］ 取本品内容物 3g，加乙醇 20ml，超声处理 20min，滤过，滤液浓缩至约 2ml，作为供 试品溶液。另取栀子对照药材粗粉 1g 和按处方量从中除去栀子的阴性对照品粗粉 3g，分 别加乙醇 10ml 和 20ml,同法制成对照药材溶液和阴性溶液。再取栀子苷对照品，加乙醇制 成每毫升含 2mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各 5μgl，分别点于同一以羧甲基 纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮Ⅱ-甲酸-水﹙5∶1﹚5∶1﹚1∶1﹚1﹚ 为展开剂，展 开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中， 在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照色谱中无相应的 斑点。见图 2。 2.1.3 黄柏的鉴别 取本品内容物 2g，加甲醇 20ml,超声处理 20min，滤过，滤液浓缩至 2ml，作为供试 品溶液。另取黄柏对照药材粗粉 0.2g 和按处方量从中除去黄柏的阴性对照品粗粉 2g，分 别加甲醇 10ml 和 20ml,加热回流提取 15min，过滤，滤液浓缩至干，各加 1ml 甲醇使溶解， 分别作为对照药材溶液和阴性对照溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每毫升含 0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各 3μgl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为 粘合剂的硅胶 G 薄层板上，以苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液﹙6∶1﹚3∶1﹚1.5∶1﹚1.5∶1﹚0.5﹚ 为展 开剂，置氨蒸气饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯﹙365nm﹚下检视。供 试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。见图 3。 2.1.4 黄芪的鉴别［1］ 取本品内容物 4g，加正丁醇 30ml，超声处理 1h，滤过，滤液用 1%氢氧化钠溶液洗 涤 3 次，20ml/次，弃去碱液，用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水液，正丁醇浓缩至干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。。另取黄芪对照药材粗粉 1g 和按处方量从中除 去黄芪的阴性对照品粗粉 4g，分别加正丁醇 15ml 和 30ml，同法制成对照药材溶液和阴性 对照溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每毫升含 1mg 的溶液，作为对照品溶液。吸 取供试品溶液和阴性对照品溶液各 8μgμgl，对照药材溶液 6μgl，对照品溶液 4μgl，分别点于同 一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水 ﹙10∶1﹚20∶1﹚11∶1﹚5﹚10 ℃ 以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙 醇溶液，置 105℃烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相 应的位置上，显相同颜色斑点。见图 4。 2.1.5 五味子的鉴别［1］ 取本品内容物 5g，置索氏提取器中，加氯仿 30ml，回流提取 3h，回收氯仿，残渣加 氯仿 2ml 使溶解，作为供试品溶液。另取五味子对照药材粗粉 2g 和按处方量从中除去五味 子的阴性对照品粗粉 5g,分别置索氏提取器中，各加氯仿 15ml 和 30ml，同法制成对照药材 溶液和对照品溶液。再取五味子乙素对照品，加氯仿制成每毫升含 1mg 的溶液，作为对照 品溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性溶液各 5μgl，对照品溶液 3μgl，分别点于同 一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 GF254 薄层板上，以石油醚﹙30～60℃﹚-甲酸乙酯甲酸﹙15∶1﹚5∶1﹚1﹚ 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯﹙254nm﹚下检视。 供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。见图 5。 2.2 含量测定 2.2.1 色谱条件的选择 色谱柱 KromasilC18μg﹙200mm×4.6mm,5μgm﹚, 流动相：甲醇-水-冰醋酸﹙55∶1﹚45∶1﹚0.5﹚ 流速 1.0ml/min；检测波长 28μg0nm；柱温 25℃；理论板数按黄芩苷峰计应不低于 1500。 2.2.2 标准曲线的制备 精密称取干燥至恒重的黄芩苷对照品 2.92mg，置 50ml 量瓶中，加适量甲醇溶解，稀 释至刻度，摇匀，制成每毫升含 0.0058μg4mg 的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液 2，4，6，8μg，10μgl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以黄芩苷进样量微克 数为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得一直线，计算回归方程为 Y=2.43×106X3.74×104，r=0.9997（n=5﹚.结果表明黄芩苷在 0.1168μg～0.58μg40μgg 范围内线性关系良好。 2.2.3 供试品溶液的制备 取本品 10 粒，倾出内容物，研细，取 3.0g 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%乙醇 50ml,称定重量，超声处理﹙功率 250W，频率 40kHz﹚30min，放冷，再称定重 量，用 70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 2.0ml，置 10ml 量瓶中， 加 70%乙醇至刻度，摇匀后过 0.45μgm 微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。 2.2.4 精密度实验 精密吸取浓度为 0.0058μg4mg/ml 的黄芩苷对照品溶液 5μgl，重复进样 5 次，均值为 609299，RSD=0.90%﹙n=5﹚，结果表明仪器精密度良好。 2.2.5 稳定性实验 精密吸取供试品溶液 5μgl，注入液相色谱仪，分别于 0，1，3，7，12h 测定峰面积。 结果表明峰面积的 RSD 为 0.90%，表明供试品溶液在 12h 内基本稳定。 2.2.6 空白实验 取样品和按处方比例不含黄芩的诸药，按制剂工艺分别制成供试品溶液和阴性对照液， 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各 5μgl，分别注入液相色谱仪，依法 测定，结果阴性对照品溶液在与黄芩苷对照品溶液相同保留时间处无色谱峰，表明无干扰。 见图 6。 2.2.7 重复性实验 取同一批号样品，按供试品制备方法平行制备 5 份，依法测定黄芩苷峰面积，分别计 算含量，RSD 为 1.24%，表明重复性良好。 2.2.8μg 回收率实验 采用加样回收法，精密称取已知黄芩苷含量的同一批号样品(n=5)040105)5 份，1.6g/份， 分别精密加入黄芩苷对照品 8μgmg，按含量测定方法操作测定，计算，平均回收率为 99.06%，RSD 为 1.4%。结果见表 1。表 1 回收率考察数据（略） 2.2.9 样品含量测定 取 3 批样品依法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 5μgl，分别注入 液相色谱仪，测定峰面积，计算样品中黄芩苷的含量。结果见表 2。表 2 样品含量测定数 据（略） 3 讨论 在黄柏的薄层色谱鉴别实验中，黄柏鉴别项下［1］的展开剂，醋酸乙酯-丁酮Ⅱ-甲酸水﹙10∶6∶1∶1﹚ 6∶6∶1∶1﹚ 1∶6∶1∶1﹚ 1﹚ 进行实验，结果分离效果不好，Rf 值较小，相邻斑点分不开。后来选用黄 连鉴别项下的展开剂，经过多次调整，把展开剂中的水换成浓氨试液，即展开剂为苯-醋酸 乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液(n=5)6∶6∶1∶1﹚3∶6∶1∶1﹚1.5∶6∶1∶1﹚1.5∶6∶1∶1﹚0.5)效果较好，结果较稳定。 流动相的选择“双黄连颗粒”项下［1］黄芩苷含量测定的流动相，试验结果发现黄芩苷 达不到基线，保留时间较短，经调整将甲醇比例增大些，醋酸比例缩小，则达到基线分离、 保留时间合适，故流动相选用甲醇-水-冰醋酸﹙55∶6∶1∶1﹚45∶6∶1∶1﹚0.5﹚。 采用参考文献［1］方法对肝愈胶囊进行薄层色谱鉴别，重现性好，阴性实验无干扰， 经多批样品鉴别，均能检出与对照药材相同的斑点。采用“双黄连颗粒”项下［1］黄芩苷含 量测定的流动相经调整后，基线分离及保留时间合适，各批次含量较稳定，为肝愈胶囊质 量控制提供有效的方法。 【摘要】目的建立丹芩颗粒的薄层色谱（TLC）鉴别方法，为控制其产品质量提供依 据。方法采用 TLC 法对仙鹤草、柘树根、白花蛇舌草、绞股蓝、柴胡、猫爪草、鸡血藤进 行了定性鉴别。结果在 TLC 色谱中均能检测出仙鹤草、柘树根、白花蛇舌草、绞股蓝、柴 胡、猫爪草、鸡血藤。结论定性方法准确可行，重复性好，可作为丹芩颗粒的质量标准。 【关键词】丹芩颗粒薄层鉴别质量标准 Abstract： ObjectiveToestablishTLCmethodforDanqinGranules．MethodsAgrimoniapilosaLedeb，C udraniatricuspidata(n=5)carr.)Bur.，HedyotisdiffusaWilld，Gynostemmapentaphyllum(n=5)Thunb. )Makino，BupleurumchinenseDC.，RanunculusternatusThunb.，SpatholobusSuberectu sDumninXianlingcaoGranuleswereidentifiedbyTLCmethod．ResultsAgrimoniapilosaLede b，Cudraniatricuspidata(n=5)carr.)Bur.，HedyotisdiffusaWilld，Gynostemmapentaphyllum(n=5)T hunb.)Makino，BupleurumchinenseDC.，RanunculusternatusThunb.，Spatholobussube rectusDumncouldbeidentifiedbyTLC．ConclusionThismethodisaccurateandhighlyreprodu cible．ItcanbeusedforthequalitycontrolofDanqinGranules． Keywords：DanqinGranules;TLC;Qualitystandard 丹芩颗粒是天津药物研究院根据多年临床经验方研究的中药复方制剂，具有益气养血、 散瘀止痛、解毒消肿、健脾化痰、软煎散结的作用，用于治疗消化道肿瘤。该制剂由仙鹤 草、柘木、黄芩、丹参等药组成，化学成分十分复杂。为了更好地控制产品的质量，笔者 采用 HPLC 法对其君药丹参和黄芩进行了含量测定（另文报道），采用薄层色谱法对制剂 中的仙鹤草、柘树根、白花蛇舌草、绞股蓝、柴胡、猫爪草、鸡血藤进行了鉴别。 1 仪器与试药 超声仪（AutoscienceAS3120）；硅胶 G 板、硅胶 GF254 板（青岛海洋化工厂）； 甲醇、三氯甲烷、乙醚、醋酸乙酯等试剂均为分析纯。 丹芩颗粒（自制）；仙鹤草、柘树根、猫爪草、鸡血藤、白花蛇舌草、绞股蓝、柴胡 (n=5)购自安徽亳州药材有限公司)。 2 方法与结果 2.1 仙鹤草的薄层鉴别取本品细粉 10g，加石油醚（60～90℃）30ml，超声处理 30min，滤过，滤液挥干石油醚，加三氯甲烷 2ml 使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草 对照药材 5g，同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法［1］试验，吸取供试品液 10μgl，对 照药材液 5μgl。分别点于同一块硅胶 G 薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-冰醋酸（25∶6∶1∶1﹚5∶6∶1∶1﹚1）为 展开剂，展开，取出，烘干，于紫外 365nm 下检视。供试品色谱中在与对照品色谱相应的 位置上显相同颜色的斑点。见图 1。 2.2 柘树根的鉴别取本品细粉 10g，加甲醇 40ml，超声提取 30min，离心，上清液蒸 干，残渣加水 10ml 溶解，离心，上清液置分液漏斗中，加三氯甲烷 5ml，振摇提取，弃去 三氯甲烷液，水层挥去三氯甲烷后，加入乙醚振摇提取两次，10ml/次，合并乙醚层，蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取柘树根对照药材 2g，加水 50ml，回流提 取 2h，放冷，滤过，滤液置分液漏斗中，加醋酸乙酯振摇提取两次，每次 30ml，合并醋 酸乙酯层，蒸干，残渣加甲醇 1ml 溶解，作为对照药材溶液。分别吸取对照药材溶液、供 试品溶液各 10μgl，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以环己烷2487三氯甲烷2487醋酸乙酯（4∶6∶1∶1﹚1∶6∶1∶1﹚2） 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照 药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图 2。 2.3 白花蛇舌草的鉴别称取本品细粉 10g，加甲醇 30ml，超声提取 30min，放冷至室 温，离心，上清液蒸干甲醇，残渣加水 10ml 溶解，离心，上清液置分液漏斗中，用石油 醚(n=5)60～90℃)振摇提取 3 次，10ml/次，醚液弃去，水层挥干石油醚，用三氯甲烷振摇提取 3 次，10ml/次，合并三氯甲烷层，蒸干，残渣加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取 白花蛇舌草对照药材 1.0g，加石油醚(n=5)60～90℃)30ml，超声振摇提取 30min，放冷至室温， 滤过，滤渣挥干石油醚，滤渣加甲醇 30ml，超声提取 30min，放冷至室温，滤过，滤液蒸 干甲醇，残渣用甲醇溶至 2ml，滤过，滤液作为对照药材溶液。分别吸取供试品溶液 10μgl，对照药材溶液 5μgl，点于同一硅胶 GF254 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇2487冰醋酸 （30∶6∶1∶1﹚5∶6∶1∶1﹚1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下检视，供试品色谱中， 在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光淬灭斑点。见图 3。 2.4 绞股蓝的鉴别称取本品细粉 5g，置具塞离心管中，加水 8μgml，使呈湿润状态，再 加以水饱和正丁醇 25ml，振摇提取，离心，取正丁醇层置 40ml 具塞离心管中，加以正丁 醇饱和的水 10ml，振摇提取，离心，取正丁醇层，蒸干，残渣用甲醇溶至 2ml，滤过，滤 液作为供试品溶液。称取绞股蓝对照药材 0.5g，置具塞离心管中，加水 2ml，使呈润湿状 态，再加以水饱和正丁醇 20ml，振摇提取，离心，取正丁醇，置 40ml 具塞离心管中，加 以正丁醇饱和的水 10ml，振摇提取，离心，取正丁醇层，蒸干，残渣用甲醇溶至 2ml，滤 过，滤液作为供试品溶液。分别吸取上述对照药材溶液、供试品溶液各 5μgl，分别点于同 一高效硅胶 G 薄层板上，以正丁醇2487醋酸乙酯2487水（4∶6∶1∶1﹚1∶6∶1∶1﹚5）的上层溶液为展开剂，展开，取 出，晾干，喷以硫酸溶液（1→10），在 105℃下加热至斑点清晰，置紫外灯（365nm） 下检视，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图 4。 2.5 柴胡的鉴别取本品细粉 20g，加水 60ml 使溶解，离心，上清液用水饱和的正丁醇 振摇提取 4 次（75，75，50，50ml），合并正丁醇液，氨试液洗涤两次（50，50ml）， 减压浓缩至干，残渣加水 40ml 使溶解，离心，上清液通过 D101（10ml）型大孔吸附树脂 柱（内径 1.5cm，长 15cm），以水 50ml 洗脱，弃去水液，再用 30％乙醇 40ml 洗脱，弃 去洗脱液，继用 70％乙醇 40ml 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶至 2ml，滤过， 滤液作为供试品溶液。另取柴胡对照药材 1.0g，置具塞三角瓶中，加甲醇 20ml，超声处理