医药学论文：探析大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施

1 材料和方法
1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.2 台盼蓝拒染实验 将0.4 %的台盼蓝染液与等体积单细胞悬液混合，染色2～3 min ,取1 滴混合悬液于细胞计数器内。镜下观察可见，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，计数蓝染细胞和未蓝染细胞。细胞存活率按以下公式计算:
1.2.3 瑞氏-姬姆萨染色 取5 μl单细胞悬液于载玻片上，制成涂片。待涂片晾干后，按瑞氏-姬姆萨染液试剂盒说明书操作。染色完成后，在倒置显微镜下观察细胞染色情况，鉴定单细胞悬液中AM纯度。计算公式如下：
2 结 果
A.肺泡巨噬细胞贴壁2 h;B. 肺泡巨噬细胞贴壁2天
2.3 瑞氏-姬姆萨染色结果 AM胞质呈灰色，胞质颗粒呈细小淡紫红色，核呈紫红色;同时可见核呈紫红色、胞质呈浅红色并有淡紫红色颗粒的中性粒细胞。AM细胞纯度≥95%(图3)。图2 肺泡巨噬细胞台盼蓝染色(×400) 图3 肺泡巨噬细胞瑞氏-姬姆萨染色(×600)
目前原代AM培养在分离、培养过程中存在多种技术难题。在分离AM时，本实验运用了多种改良措施，获得了满意的效果：①灌洗前一定要把肺内血液驱除彻底，减少灌洗液中红细胞数量，减少杂质;②重悬细胞单细胞悬液时，要充分吹打细胞使之分散均匀，利于细胞贴壁;③PBS洗板及给细胞换液时，动作要缓慢，以免贴壁细胞脱壁，影响收集肺泡巨噬细胞的数量。
另外，在培养细胞过程中，菌室和超净台要常规消毒，整个过程要注意无菌操作，防止细胞污染。 综上所述，本实验采用以上改良措施后，经台盼蓝拒染试验及瑞氏-姬姆萨染色方法鉴定，可以得到大量纯度高、活性好的AM，为开展大鼠肺泡巨噬细胞的生物学功能及细胞生理、病理模型研究奠定了良好基础。