医药学论文：研究荨麻提取物中水溶性成分的5a-还原酶抑制活性

摘要：　目的研究荨麻提取物中水溶性成分的5a-还原酶抑制活性。方法基于荧光测定的方法，建立一种5a-还原酶抑制剂体外模型，从大鼠前列腺组织中提取5α-还原粗酶,与底物睾酮（Testosterone）以及供氢体还原型辅酶Ⅱ（NADPH）共同组成了一种微量反应体系。利用荧光测定仪检测NADPH的含量，以荧光的强弱来判断5a-还原酶的活性，以非那雄胺作为阳性对照。结果同对照组相比，反应体系中加入荨麻提取物后荧光值有显著升高。结论荨麻根的水溶性成分在体外能够抑制5a-还原酶的活性。

关键词： 5α-还原酶 荨麻 双氢睾酮 前列腺增生
良性前列腺增生症(BPH) 是中老年男性常见病与多发病，发病率在40 岁时约为23%， 至90 岁时可达88%。在寻找其治疗药物过程中，甾体5α- 还原酶抑制剂已成为研究热点之一［1］。从构效关系看，5α-还原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白,依赖还原型辅酶II(NADPH) 作为供氢体，该酶广泛存在于前列腺及其它组织和器官中，是睾酮转变为双氢睾酮的催化剂［2］，它不可逆地催化睾丸酮 (T)转为生理活性更强的双氢睾丸酮 (DHT)，DHT被认为是良性前列腺增生症(BPH)的主要病因, 抑制该酶活性, 减少DHT生成，已经成为BPH 非手术治疗的主要途径［3］。
首先建立酶催化反应体系，利用辅酶NADPH具有自发荧光特性（NADPH本身有强烈荧光，当NADPH与还原酶和底物反应后，NADPH生成NADP+, 荧光随之淬灭）通过荧光检测仪测定NADPH的含量来考察5α-还原酶的活性［5］。
1.1 药品与试剂非那雄胺(保列治), Merck Sharp & Dohme (U.K.)Ltd。批号J20050041；睾酮，上海久邦化工公司产品，批号20051106；NADPH，Biosharp公司产品， 批号041939；其他化学试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.2 5α-还原酶活性测定和反应条件优化取5.0 ml的小试管，将底物、酶提取液,辅酶等反应成分依次加入，然后加入缓冲液（PBS 2.0 mmol/L, 蔗糖 0.2 mol/L, EDTANa2 1.0 mmol/L, pH 6.8）至2 ml，在37℃下反应1 h。然后用荧光检测仪测定反应体系的荧光值。为了获得最佳酶活性测定反应参数，对反应温度、底物、酶的浓度以及反应时间的反应条件进行优化，同时以特异性5α-还原酶抑制剂非那雄胺［8,9］作为阳性对照。
3 结果
3.2 睾酮浓度对酶活性的影响在固定酶提物浓度（1.2 mg/ml）和辅酶NADPH的浓度（1 mmol/L）的条件下，逐步增加睾酮浓度，分别是：0.1，0.2，0.5，2.0，20.0 μmol/L和200 μmol/L，在37℃条件下反应1 h，测定荧光值。如图1所示，当底物浓度在0～0.5 μmol/L时，随着睾酮浓度变大，荧光值降低，但当底物浓度增加10倍，100倍时，荧光值不再变化，说明当睾酮浓度到0.5 μmol/L时，即可获得较高的酶活性。

3.5 反应时间对酶活性的影响在固定酶的浓度和底物浓度的情况下，测定不同时间点荧光值的变化情况，时间点分别是：5，10，20，30，60，90，120 min。如图4显示，随着反应时间的延长，荧光值逐渐下降，在反应60 min以后，荧光值趋于恒定，说明酶已经反应完全，以60 min作为反应时间。
3.6 阳性对照药对酶活性的影响向反应体系中加入特异性还原非那雄胺，浓度依次为：10，25，50，75，100 μmol/L。结果显示，非那雄胺呈浓度依赖性抑制酶促反应，浓度达到50 μmol/L时，显示较强的抑制作用，表明采用荧光测定建立的5α-还原酶活性测定方法具有专一性。