医药学论文：银屑病患者中CXC型趋化因子受体CXCR2 mRNA 的表达

【摘要】 目的 测定CXC型趋化因子受体CXCR2 mRNA在银屑病患者中的表达情况，弄清该受体在银屑病患者中的病理生理状态，探讨其在银屑病发病机制中的作用。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测33例进行期斑块型银屑病患者治疗前皮损部位、皮损周围外观正常皮肤和外周血中性粒细胞、单一核细胞及其中16例治疗至皮损消退70％以上的患者外周血中性粒细胞与单一核细胞中CXCR2 mRNA的表达水平，并设30例健康人为对照组。将检测结果与银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）及外周血中性粒细胞、单一核细胞中该受体的表达水平与皮损部位表达水平之间分别进行了相关性分析。结果 银屑病患者皮损部位表皮与真皮中CXCR2 mRNA表达水平分别为1.85±0.76和1.23±0.48，明显高于皮损周围外观正常皮肤表皮及真皮(分别为0.63±0.48和0.86±0.39；分别P＜0.001，P＜0.01)，及健康对照者皮肤表皮及真皮（分别为0.59±0.21和0.55±0.48，P均＜0.001)，且均与PASI呈显著正相关（表皮：r=0.86，P＜0.001; 真皮：r=0.38，P＜0.05）。银屑病患者外周血中性粒细胞中CXCR2 mRNA表达水平为1.45±0.87，明显高于健康对照及治疗后患者（分别为0.74±0.58，P＜0.001； 0.63±0.58，P＜0.01），并与PASI呈显著正相关（r=0.84，P＜0.001）。银屑病患者外周血单一核白细胞中CXCR2 mRNA的表达水平为1.38±0.87，明显高于健康对照组（0.73±0.58，P＜0.001)。银屑病患者皮损部位表皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血中性粒细胞中该受体的表达水平呈正相关（r=0.61，P＜0.001）； 银屑病患者皮损部位真皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血单一核白细胞中的该受体的表达水平呈正相关（r=0.64，P＜0.001）。结论 CXCR2在银屑病患者中的表达均异常增高，可能参与了银屑病的发病机制。
【关键词】 银屑病；受体；趋化因子
【Abstract】 Objective To investigate the expression levels of chemokine receptors CXCR2 in progressive plaque psoriasis and their clinical significance.Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) technique was applied to semi-quantitatively analyze CXCR2 mRNA expression levels in epidermis and dermis from lesion and peri-lesion skin，Peripheral Blood polymorphonuclears(PMN)and peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in each of 33 cases of psoriatic patients before treatment and PMN and PBMC in16 cases from the 33 patients treated until the skin lesions remission about 70% and 30 healthy controls.The correlations between CXCR2 mRNA values and psoriatic area and severity index (PASI)，and between the CXCR2 mRNA values in PBMC and PMN and in leision dermis and epidermis were evaluated，respectively.Results （1）The CXCR2 mRNA levels in lesion epidermis and dermis in psoriatic patients were 1.85±0.76 and 1.23±0.48，respectively，which were markedly higher than those in peri-lesion epidermis and dermis（0.63±0.48 and 0.86±0.39，respectively，P＜0.001，P＜0.01，respectively) and normal epidermis and dermis（0.59±0.21 and 0.55±0.48，respectively，both P＜0.001).Furthermore，positive correlation were noticed both between epidermis CXCR2 mRNA values and PASI (r=0.86，P＜0.001)，and dermis CXCR2 mRNA values and PASI(r=0.38，P＜0.05).（2）The CXCR2 mRNA levels in PMN from psoriatic patients were 1.45±0.87，which were markedly higher than those in normal controls and treated patients（0.74±0.58，P＜0.001 and 0.63±0.58，P＜0.01 respectively）. Positive correlation were noticed between CXCR2 mRNA values and PASI（r=0.84，P＜0.001）.（3） CXCR2 mRNA expression levels in PBMC from psoriatic patients were 1.38±0.87，which were markedly higher than those in normal controls（0.73±0.58，P＜0.001) but similar with treated patients(1.21±0.62)，furthermore，the later were also markedly higher than those in normal controls(P＜0.05).（4）Positive correlation were noticed between the CXCR2 mRNA values in lesion epidermis and inPMN，and in lesional dermis and in PBMC，respectively.Conclusion The increased expression of CXCR2 maybe involved in the pathogenesis of progressive plaque psoriasis.
【Key words】 psoriasis；receptor；Chemokine CXCR2
银屑病是一种慢性炎症性疾病，病因及发病机制至今仍尚未完全明确。现认为银屑病的发病主要涉及免疫、炎症、新血管生成及角质形成细胞过度增殖等四个方面。趋化因子及其受体系统具有广泛的生物学作用，在免疫及炎症过程中起着重要作用。趋化因子通过趋化因子受体发挥作用。CXCR2为CXC型趋化因子白介素8（IL-8）及生长相关癌基因α（GRO-α）的特异性受体，已有研究显示银屑病皮损部位 IL-8 及GRO-α增高，为了解趋化因子受体在银屑病患者中的病理生理状态，笔者用RT-PCR法检测了CXC型趋化因子受体CXCR2在银屑病患者中的表达情况。
1 资料与方法
1.1 病例选择 明确诊断的中重度进行期斑块状银屑病患者33例，均为2002年3～12月在我院就诊的门诊或住院患者，男19例，女14 例，年龄18～65岁，平均（34.71±10.26）岁，病程4个月～40年，平均（9.76±7.35）年。用PASI评分法来评估患者的疾病严重程度。入选标准：年龄在18周岁以上，诊断明确，PASI评分在8.4以上；近3个月内未用过维甲酸制剂、皮质类固醇激素及免疫抑制剂，1个月内未用过治疗银屑病的内服及外用药物，无其他系统性疾病或皮肤疾病。排除标准：近半年内服用过皮质类固醇、免疫抑制剂或维甲酸制剂；近1个月内服用过口服治疗银屑病或其他系统治疗药物，近1个月内外用过治疗银屑病的药物；伴有糖尿病、高血压等其他系统性疾病；患者就诊时怀孕、哺乳或处于月经期。
1.2 标本收集 对符合上述入选标准的患者详细记录病史资料，然后自肘静脉取血8ml加入肝素抗凝管备分离白细胞；接着用8mm角膜环钻分别自皮损部位及皮损周围外观正常皮肤各钻取一块皮肤组织，钻取深度以达到真皮全层为宜，用刀片沿皮面平行切下皮肤组织，迅速放入液氮中速冻或直接用0.25%分散酶消化。标本收集完毕后根据患者的病情给予相应的抗银屑病药物治疗，病情较轻者给予口服银屑冲剂或复方青黛丸，外用煤焦油凝胶、硫柳软膏及去炎松霜等，病情较重者给予口服雷公藤、红霉素及外用煤焦油凝胶、硫柳软膏及去炎松霜等。上述患者经有效治疗至皮损消退70%以上时取疗后血，取血前再次对患者进行PASI评分，共收集到16例治疗后患者。正常对照30例，均来自我院研究生、体检职工及皮肤外科整形美容的患者，年龄、性别与患者具有可比性。
1.3 主要仪器及试剂 XL-70超高速离心机（BECKMAN），Hema 480基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司），TFX-20M紫外检测仪（Vilber lourmat 法国），CS-9000双波长飞点薄层扫描仪（日本岛津）。Trizol （GIBICO/BRL），Super ScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen），TaqDNA聚合酶（Promega），DNA片段长度标准（上海华美生物工程公司），琼脂糖（Promega）。
1.4 特异性引物 CXCR2 5- CTTTTCTACTAGATGCCGC -3，5-AGATGCTGAGACATATGAATTT -3，扩增片段为417bp；β-Actin 5-CAACTCCATCA TGAAGTGGTAAC -3，5-CCACACGGAGTACTTGCGCGCCTC-3扩增片段为180bp，所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.5 方法
1.5.1 表真皮分离 用0.25%分散酶消化分离真表皮，分离后的真表皮分别被置入2个加入Trizol的玻璃研磨器中匀浆备用。
1.5.2 中性粒细胞与单一核细胞的分离 将肝素抗凝静脉血8ml用无钙、镁Hank液对倍稀释，以4∶1的比例向稀释后的血中加入6%葡聚糖，混匀后37℃静置40min，静置后含上述液体的血液混合物分为两层，上层清亮液中含有白细胞。取上层清亮液以3∶2比例沿管壁缓慢加至另一试管中的分层液表面，2000r/min 离心20 min，离心后单一核白细胞位于上层血浆与下层分层液的交界处，中性粒细胞位于管底，分别将单一核白细胞及中性粒细胞移入干燥试管，各用5倍于细胞的Hank液洗2次，在显微镜下记数，取2×106个单一核白细胞及8×106个中性粒细胞加入Trizol备用。
1.5.3 提取RNA 采用Trizol试剂，按说明书操作提取RNA。
1.5.4 反转录合成cDNA 严格按照Invitrogen的试剂盒说明书进行操作。合成cDNA的总体积为20μl。具体如下：10mmol/L dNTP mix 1μl，Oligo（DT）12-181μl，RNA模板8μl，65℃孵育5min，置于冰上至少1min，加入由10×RT 缓冲液2μl，25mmol/L MgCl2 4μl，0.1mmol/L 二硫苏醇糖（DTT） 2μl，RNA酶抑制剂1μl组成的反应混合物9μl，42℃孵育2min，加入逆转录酶1μl，42℃孵育50 min，70℃孵育15min终止反应，置于冰上至少1min，加入RNA酶1μl，37℃孵育20min，去除残余的RNA，获得cDNA。
1.5.5 PCR扩增 反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/L MgCL2 1.5μl，10 mmol/L dNTP mix 0.5μl，等量上下游引物混合物1μl，相应cDNA 1μl。扩增条件为： 94℃预变性5min。94℃变性33s； 57℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。以β-Actin作为内参照进行半定量。
1.5.6 电泳及照相 用2%琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5×Tris-硼酸，以每厘米胶长5V的电压进行电泳，1h后在紫外发射仪上观察结果并进行近距离摄影。
1.6 图像分析及统计学方法 胶片用薄层扫描仪扫描，所有扩增产物的扫描峰面积值均以相应β-Actin为基准校正后得到扩增产物的相对半定量值。统计学分析采用SPSS 10.0软件包进行处理，采用方差分析法对各组数据进行组间比较。相关性分析采用Pearson模型。
2 结果
治疗前患者的PASI评分为8.4～47.2，平均27.26±8.84；所收集到的治疗后患者的PASI评分治疗前为10.8～43.2，平均25.61±10.78，治疗后为1.2～15.3，平均5.02±3.90，治疗后比治疗前平均下降了80.75%。CXCR2 mRNA的表达情况见表1及图1～4。