医药学论文：载脂蛋白E基因多态性与轻度认知障碍的关系

【摘要】 目的 探讨载脂蛋白E（apoE）基因多态性与轻度认知障碍（MCI）的关系。方法 应用限制性片段长度多态分析-聚合酶链反应（RFLP-PCR）方法，测定56例MCI患者和89例同龄对照组apoE基因型和等位基因频率。结果 MCI组ε2、ε3、ε4等位基因频率分别为7.14%、71.38%和21.48%，而同龄对照组分别为7.30%、84.83%和7.87%。apoEε4等位基因在MCI患者中出现的频率明显高于对照组，统计学分析说明差异具有非常显著性（P< 0.01）。结论 apoEε4等位基因是MCI的危险因素。
【关键词】 轻度认知障碍；多态性；载脂蛋白E；基因型

【Abstract】 Objective To analyse the association of apolipoprotein E(apoE) genotypes with mild cognitive impairment(MCI).Methods RFLP-PCR technology is applied to analyse the apoE allele frequency of 56 MCI patients and 89 controls.Results Among the 56 cases of MCI，the frequency of apoEε2，ε3，ε4 are 7.14%，71.38%，21.48% respectively，while in the 89 controls they are 7.30%，84.83%，7.87% respectively.The frequencies of the two groups have significant difference(P< 0.01)and the frequency of apoEε4 allele is higher in MCI than that in the controls and the statistical treatment suggest that there is significant difference（P< 0.01）.Conclusion The apoEε4 allele is a genetic risk factor of MCI.
【Key words】 mild cognitive impairment;polymorphism;apolipoprotein E;genotypes
轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）特指有轻度记忆或认知损害、但无痴呆的老年人，其病因不能由已知的医学或神经精神病状况解释。目前普遍认为MCI是介于年龄相关性记忆损害（age-associated memory impairment，AAMI）和老年性痴呆（Alzheimers disease，AD）之间的一种综合征。许多资料表明：MCI患者进展为AD（主要指散发性AD）的年转化率是同龄认知功能正常老年人的10倍，识别MCI患者将有助于早期干预和治疗，所以MCI相关研究成为近年来国内外的热门话题。
近年来，越来越多的研究发现多个基因，如淀粉样蛋白前体（APP）基因、早老素-1（PS-1）基因、早老素-2（PS-2）基因、载脂蛋白E（apoE）等位基因和低密度脂蛋白受体相关蛋白基因等遗传因子在调控AD病理和生化异常代谢中起着重要作用。其中，位于19号染色体的apoE基因是资料与目前唯一广泛得以认同的与散发性AD和迟发性家族性AD相关的基因。本研究旨在探讨apoE基因多态性与MCI之间的关系，为MCI易进展为AD寻找遗传学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 研究对象源自武汉市中心医院2002年7月~2003年6月神经内科和干部四科门诊和病房，所有对象的文化程度均在中学及以上，分为MCI组和对照组。MCI组56例，男23例，女33例；年龄61～89岁，平均（70.12±7.24）岁。依据1997年Peterson等确立的诊断依据确定MCI组入选标准如下：（1）有记忆力减退的主诉；（2）检查时证明有轻度记忆损害；（3）没有或很少有其他认知损害；（4）日常生活活动正常（BI指数≥95分）；（5）满足CDR=0.5的标准；（6）MMSE评分≥24分，但≤27分；（7）不够NINDS-ADRDA或DSMⅢ-R对痴呆的标准。排除标准：（1）昏迷；（2）失语和（或）精神异常（如抑郁、谵妄）而不能配合量表检查者。
对照组89例，男46例，女43例；年龄60～88岁，平均（69.47±8.02）岁。均符合下述入选标准：（1）无记忆力减退的主诉；（2）检查时排除认知缺损、CDR=0；（3）日常生活活动正常；（4）MMSE评分＞27分；（5）年龄、性别、受教育程度、既往高血压、糖尿病、心脏病及卒中史均与MCI组匹配。对照组和MCI组在年龄上差异无显著性（P>0.05）。
1.2 研究方法
1.2.1 基因学检查 用PCR-RFLP方法测定apoE基因型。实验步骤如下：（1）空腹12h后，取肘静脉血5ml，EDTANa2抗凝，用酚：氯仿抽提白细胞中的DNA，使纯度达到A280/A260>1.8；（2）PCR扩增目的基因片段：参照文献［1］，引物设计如下：上游引物为5'-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3'和5'-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3'。扩增体系为50μl。PCR的条件为95℃变性5min，之后35次循环（94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min），72℃继续延伸10min后降至4℃，用1.6%琼脂糖凝胶电泳待测扩增产物；（3）限制性片段长度多态性（RFLP）分析：取10μl PCR产物，加10u HhaI内切酶消化，37℃酶切4h，非变性聚丙烯酰胺浓度为0.1g/L，交联度为49∶1，取5μl酶切产物，加等体积的甲酰胺变性液，在电压100～200V，温度20℃条件下，电泳5h左右；（4）银染：电泳结束后，用乙酸固定，纯水洗，银染液染色（1.4g/L，AgNO3和甲醛），纯水洗，加显色液（30g/L，Na2CO3，甲醇400μg/L，Na2S2O3）显色，乙酸终止反应，根据电泳带型确定apoE基因型。拍片。
1.2.2 统计学分析 使用SPSS 10.0处理数据，计算各等位基因和基因型频率的分布，基因频率采用Hardy-Weinberg遗传平衡式计算。两组的apoE基因型或等位基因频率比较采用卡方检验。
2 结果
2.1 PCR扩增产物和HhaI酶切PCR扩增产物电泳结果 ApoE基因的PCR扩增片段大小为244bp，经HhaI酶切后，ε2型酶切产物的主要片段为91bp/83bp；ε3型酶切产物的主要段为91bp/48bp/35bp；ε4型酶切产物的主要段为72bp/48bp/35bp。即可根据apoE PCR产物酶切后的片段长度来判断其等位基因情况（见图1）。
2.2 apoE基因型和等位基因频率分析 MCI组和对照组的基因型和等位基因频率结果，见表1。结果显示MCI组和对照组的纯合子基因型均以ε3/ε3型最多（分别为55.36%和71.91%），ε4/ε4型最少（分别为3.67%和1.12%），未检出ε2/ε2型；MCI组的杂合子基因型以ε3/ε4型最多（26.69%），ε2/ε4型次之（8.92%），ε2/ε3型最少（5.36%）；对照组的杂合子基因型以ε2/ε3型最多（13.48%），ε3/ε4型次之（12.37%），ε2/ε4型最少（1.12%）。等位基因中ε3频率最高（MCI组和对照组分别为71.38%和84.83%），ε4次之（分别为21.48%和7.87%），ε2最少（分别为7.14%和7.30%）。组间比较显示：两组apoE基因型分布总体比较其差异在统计学上差异有非常显著性（χ2=10.52，P< 0.01）；基因频率总体比较差异有显著性（χ2=7.48，P< 0.025）。