医药学论文：小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

【摘要】 应用RT-PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm-T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。

 

【关键词】 CXCL10；基因克隆；真核表达载体

 

Gene cloning and eukaryotic expression vector construction of murine CXCL10

 

【Abstract】 The cDNA fragment encoding the murine CXCL10 was obtained from mRNA of mouse T cells by using reversal transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR)and contained a signal peptide derived from the human monocyte chemoattractant protein 1, then it was cloned into the Pucm-T vector. By partial nucleotide sequencing, the cDNA was consistent with the reported mCXCL10 cDNA in the gene bank, and then was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). The recombinant plasmid was transfected into COS-7cell line by DOTAP liposome. The expression of the target molecule was assayed by Western blot and chemotaxis assay.It was found that the cells transfected with plasmid vector could express mCXCL10 protein and it's culture supernatants could attract T cells markedly. The successful construction of mCXCL10 eukaryotic expression vector lays the foundation for it's further researching in treatment of tumor.

 

【Key words】 CXCL10; gene cloning; eukaryotic expression vector

 

趋化因子CXCL10 (IFN-γ inducible protein-10, IP-10)，属于CXC家族的非ELR趋化因子，主要由活化的单核及巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。CXCL10的受体CXCR3，属于具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体，由活化的T细胞等表达，CXCL10与其结合后发挥趋化作用，能够诱导活化的T细胞等趋化。另外，CXCL10还能够抑制肿瘤血管生成［1～3］。基于CXCL10的多种生物学效应，国外已开展CXCL10在肿瘤和感染性疾病等方面的应用研究。本实验旨在构建小鼠CXCL10真核表达质粒，探讨其在真核细胞中的表达，为进一步研究CXCL10的生物学活性及肿瘤的基因治疗奠定基础。

 

1 材料与方法

 

1．1 载体、菌株及主要试剂 大肠杆菌DH5α、Pucm-T载体和真核表达载体pcDNA3.1(+)原购自Invitrogen公司。COS-7细胞购自中科院上海细胞生物所。RT-PCR试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ购自Promega公司。T4DNA连接酶和TaqDNA 聚合酶购自Promega公司。DNA片段回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自华美公司。鼠重组CXCL10细胞因子和兔抗鼠CXCL10多克隆 抗体为PeproTech公司产品，抗兔IgG-HRP为Santa Cruz公司产品。DOTAP脂质体转染试剂盒购自Roche公司。尼龙毛为日本和光纯药工业株式会社产品。引物合成及测序由上海申能博彩公司完成。

 

1．2 CXCL10真核表达载体构建 根据Genebank小鼠CXCL10基因序列（Access AF227743）及相关文献［3～5］设计引物，为在CXCL10 cDNA加上信号肽基因，设计PCR引物时5'端包含了人单核细胞趋化蛋白1的信号肽序列，由于信号肽基因较长，采用两步PCR法。常规提取小鼠脾脏细胞总RNA，按照反转录试剂盒操作要求完成RT反应合成cDNA第1链后，PCR扩增小鼠CXCL10基因，上游引物5'-CCG GAA GCC TCC CCA TCA GCA CC-3'，下游引物5'-TGT GTG CGT GGC TTC TCT CCA-3'(342bp)，反应条件为94℃预变性4 min，94℃45s、57℃45s、72℃45s，30个循环后，72℃延伸 10 min。然后以PCR产物为模板，进行巢式PCR的2次扩增，上游引物5'-ATG AAC CCA AGT GCT GCC GTC A-3'，下游引物5'-TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT-3'(297bp)，反应条件同上。电泳回收条带，采用两步PCR法在5'端加上一个69bp的信号肽基因。5'端引物 有两条，第一条5'-CTC TTC ATC TCC GGC TCC GCC TTT TCT AGG GGT ATG AAC CCA AGT GCT GCC GTC ATT-3'，第二条5'-TCA CAA GCT TAT GAA GTG GGT AAC CTT TCT CCT CCT CCT CTT CAT CTC CGG CTC CGC CT-3'；3'端引物5'-ATC GAA TTC TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT T-3'，反应条件同上。经T4 DNA连接酶将目的基因连接Pucm-T载体，转化DH5α感受态菌。经蓝白斑筛选，酶切及测序鉴定正确后，酶切插入载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点。由于扩增片段两端设计的酶切位点为EcoRⅠ和HindⅢ，而片段本身也含有一个HindⅢ位点,因此采用部分酶切，先加入EcoRⅠ酶切3 h，再加入HindⅢ酶切5 min或10 min，电泳回收正确片段，与经同样酶切的pcDNA3.1 (+)连接。将连接产物酶切鉴定并反向测序，确定载体构建准确。