【理学论文】栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析

  摘要：为探讨栀子(Gardenia jasminoides)果实中藏花素的合成机理，克隆了栀子类胡萝卜素生物合成的关键酶八氢番茄红素合成酶(GjPSY)基因的全长 cDNA。结果表明，推导的 GjPSY 氨基酸序列与双子叶植物来源的 GjPSY 亲缘关系较近。采用HPLC 检测栀子果实中的藏花素-1 含量为(3.96 ± 1.48) mg g–1，在叶片中未检出。通过 RT-PCR 分析表明，GjPSY在栀子叶片和果实中均有表达，且表达水平一致。因此推测，GjPSY的转录水平与果实中藏花素-1 的合成无关。
　　关键词：栀子；阿朴类胡萝卜素；藏花素；八氢番茄红素合成酶；基因表达
   1 材料和方法1.1材料和试剂栀子(Gardenia jasminoides)植株培养于广东药学院。采集栀子成熟叶片和花后 16 周的栀子果实，果肉为橙色。所有材料贮存于 –80℃。CreatorTMSMARTTMcDNA 文库构建试剂盒购自 Clontech公 司。Primescript one step RT-PCR 试 剂 盒 购 自TaKaRa 大连公司。藏花素-1 (Crocin-1)的对照品购于 Sigma-Aldrich 公司。乙腈、甲醇为色谱纯，其它生化试剂等为分析纯。
　　1.2藏花素-1含量的测定以改良的 HPLC测定栀子叶片和果实中藏花素-1 (Crocin-1)的含量。叶片和果实在液氮中研磨后以 50% (V/V)的甲醇-水溶液提取，在超声处理 30 min 后以 10000 ×g离心 10 min，取上清液在 –20℃下贮存。HPLC 分析时，上清液以 0.45 μm滤 膜 过 滤，以 DiamonsilTMC18 (2) 柱(250 mm ×4.6 mm, 5 μm)(Dikma 公司，中国)分析，梯度洗脱。
　　仪器为 Waters 2995 HPLC 仪(Waters 公司 , 美国)，配备 2996 光电二极管阵列检测器检测。数据分析图 1 Crocin 的生物合成途径。IPP：异戊烯焦磷酸 ; DMAPP：二甲基丙烯焦磷酸；GPP：香叶基焦磷酸；GGPP：香叶基香叶基焦磷酸。Fig. 1 Biosynthesis pathway of crocin. IPP: Isopentenyl diphosphate; DMAPP: Dimethylallyl diphosphate; GPP: Geranyl diphosphate; GGPP:
　　Geranylgeranyl pyrophosphate.第5期 441以 Empower 2 软件完成。洗脱条件为：10% ~ 20%乙腈溶液(乙腈 / 水，V/V)，0 ~ 20 min；20% ~ 50%乙腈溶液，20 ~ 25 min，流速为 1 mL min–1，检测波长 440 nm。目标峰通过与藏花素-1 对照品的保留时间和吸收光谱的比较而确定。通过标准曲线确定藏花素-1 的含量，共进行 3 次重复实验。
　　1.3 GjPSY基因的克隆以 CTAB (Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide)法提取栀子果实中的总 RNA。按照CreatorTMSMARTTMcDNA 文库构建试剂盒的说明书从总 RNA 构建栀子果实的 cDNA 文库。将获得的 SMART 双链 cDNA 克隆接入 pDNR-LIB 载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH-5α。
　　根据植物八氢番茄红素合成酶基因PSY的保守区设计简并引物，F1：5′-ATHTGGGCNATHTAY-GTNTGG-3′ 和 F2：5′-RAARTTRTTRTARTCRTTN-GCYTC-3′，从 cDNA 文库的细菌裂解液中扩增PSY基因。获得了GjPSY基因的中间片段，将该片段回收并测序，命名为GjPSY-M。根据GjPSY-M片段序列分别设计 5′ 端特异引物 GSP1：5′-GCGATA-CAACAATAGCGATGCCCATACAG-3′ 和 3′ 端 特异引物 GSP2：5′-GTGCAGGAGAACGGATGAGC-TGGTT-3′，配合文库构建试剂盒提供的 5′ 端和 3′端的质粒检测通用引物，采用 RACE 方法从 cDNA文库中获得GjPSY基因的 5′ 端和 3′ 端序列。获得的片段分别命名为5′GjPSY和3′GjPSY，将片段回收和测序并进行序列分析，与GjPSY-M拼接出GjPSY的全长 cDNA。根据全长GjPSY序列，经过 BLAST比对和开放阅读框(ORF)序列分析，分别设计引物 F1：5′-CGCCATTAATATGTCTGTCGCTTTGC-TATGGGTTG-3′和 F2：5′-ATGCTCGAGGGCCTT-TGCTAGTGGAGATGATGTTCT-3′，从 cDNA 文库的细菌裂解液中扩增得到GjPSY的 ORF 序列。
　　1.4 GjPSY基因的表达分析从栀子果实和叶片中分别提取总 RNA，采用Primescript one step RT-PCR 试剂盒进行 RT-PCR分析，反应所用GjPSY特异引物分别为F1：5′-GAC-ATACTTGCTGGAAAGGTCAC-3′ 和 F2：5′-GCTA-GTGGAGATGATGTTCTTGG-3′。以组成性表达的RPS25-1基因(40S 核糖体小亚基蛋白 25-1 基因，GenBank 登录号：GU797554)为内参，RPS25-1基因的特异引物分别为 F1：5′-CAGAAGAAGAAGA-AGTGGAGCAA-3′ 和 F2：5′-TGGTAGCTCTGGT-GTATATCTGC-3′。RT-PCR 反应程序为：95℃ 2 min，接着94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30次循环，最后 72℃延伸 7 min。扩增产物用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
　　2 结果2.1栀子叶片和果实中藏花素-1的含量使用甲醇-水溶液提取栀子叶片和果实中的藏花素-1，提取液用于 HPLC 分析。通过与 crocin-1对照品的保留时间和吸收光谱进行比较，在果实样品中观察到 crocin-1 峰，在叶片样品中未观察到crocin-1 峰(图 2)。同时，检测到果实中 crocin-1 的含量为(3.96 ± 1.48) mg g–1。
　　2.2 GjPSY基因的克隆为了克隆GjPSY基因，构建了栀子果实的cDNA 文库，以简并引物从 cDNA 文库中扩增得到GjPSY基因 cDNA 的中间片段GjPSY-M，长度为688 bp。接着通过 5′ RACE 获得了长度为 1596 bp的5′GjPSY片段；通过 3′RACE 获得了长度为 956bp的3′GjPSY片段。将5′GjPSY、GjPSY-M和3′GjPSY共 3 个片段序列进行拼接，得到全长 cDNA，长度为 1876 bp。根据全长序列从 cDNA 文库中扩增得到 ORF 序列(图 3)；经序列分析，此全长 cDNA 含有 1314 bp 的 ORF，5′ 端非翻译区为 393 bp，3′端非翻译区为 169 bp，命名为GjPSY (GenBank登陆号：HQ599860)。预测GjPSY基因编码的蛋白质含有 437 个氨基酸，分子量为 49.3 kDa，等电点为8.82。
　　2.3 GjPSY的序列分析GjPSY 的氨基酸序列经 BLAST 分析，结果表明，GjPSY 与多种植物的八氢番茄红素合成酶的序列相似，它们均含有两个保守的富含天冬氨酸的模体 DXXXD。这个模体被认为可通过 Mg2+结合于底物的焦磷酸基团，在八氢番茄红素合成酶催化两个 GGPP 分子缩合的反应中发挥重要作用。
　　采用 ClustalW2 软件对相似度较高(相似度为 55% ~ 93%)的18 条来自多种植物的八氢番茄红素合成酶序列进高蓝等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析442 热带亚热带植物学报第21卷行同源进化比对，采用 Mega 4.1 软件构建氨基酸序列的 NJ (Neighbor-joining)系统进化树，用重复1000 次的自展支持率(Bootstrap)检验各分支的置信值。结果表明，GjPSY 与中粒咖啡的 PSY最为相似，与番茄和拟南芥 PSY 的相似度均大于来自禾本科的玉米及水稻的。而在与玉米和水稻的各 3 种 PSY 的比对中可知，GjPSY 与 PSY1 最为相似，而与 PSY3 关系最远。
　　2.4 GjPSY的表达分析分别提取栀子叶片及果实中的总 RNA，采用RT-PCR 法分析GjPSY的表达水平。以组成性表达的RPS25-1为内参。结果表明，GjPSY的转录水平在叶和果实中表现一致。
　　3 讨论类胡萝卜素是异戊烯类色素，在植物的光合作用和光保护作用中发挥作用，是人体中重要的营养物质，是维生素 A 的前体。由类胡萝卜素衍生的阿朴类胡萝卜素，如藏花酸和藏花素既可作为色素使用，也具有药用作用。有研究表明，藏花素和藏花酸具有防止动脉粥样硬化、抗炎、抗细胞增殖、预防视网膜变性、神经保护作用和改善胰岛素抵抗等作用。八氢番茄红素合成酶是类胡萝卜素生物合成中的第一个限速酶，PSY基因在单子叶和双子叶植物中广泛存在基因复制现象，这个基因家族中各个基因的表达往往具有组织特异性，或对环境胁迫等因素产生应答。目前对多种植物的PSY基因的分离、表达及转基因植物的分析研究方兴未艾。
　　在柑橘果实中，PSY基因随着果实的成熟表达上调，不同品种上调幅度不同，可见柑橘的PSY 栀子果实的甲醇-水提取液的HPLC图谱。主峰是crocin-1, 检测波长440 nm，插图为crocin-1的在线吸收光谱。A: 果实；B: crocin-1对照品。
　　Fig. 2 HPLC of methanol-water extract from Gardenia jasminoides fruits. The main peak is crocin-1 monitored at 440 nm of wave length. A: Fruits; B:
　　Standard for crocin-1. Illustrations are showing online absorption spectrum of crocin-1.栀子GjPSY基因的 PCR 扩增图谱。M:DL2000marker;1:GjPSY-ORF。
　　Fig. 3 Amplification of GjPSY gene. M: DL 2000 marker; 1: GjPSY-ORF表达模式与GjPSY不同。番茄中有两个PSY基因：
　　PSY1和PSY2，它们均在幼苗、成熟叶片及果实中表达。PSY1在幼苗和果实成熟后期的表达高于PSY2，而PSY2主要在成熟叶片中表达，推测PSY1是由PSY2经基因扩增产生的平行同源基因。GjPSY 的氨基酸序列与番茄的 PSY2 的氨基酸序列较相似(相似度达 81%，与 PSY1 的相似度为 75%)，并且在果实中的表达水平与叶中相近，提示它不是与果实成熟相关的基因。两个番茄PSY1突变体，一个是 W180* 无义突变，一个是一个氨基酸替换突变体 P192L，对它们果实中的类胡萝卜素的含量和比例进行了分析。W180* 的果实为黄色果肉，直到成熟颜色都不发生变化，代谢分析表明在果实中没有类胡萝卜素，其 PSY1 蛋白失去活性，证明PSY1是唯一在果实成熟过程中发挥作用的PSY。P192L 果实也为黄色，直到破色期后的第 3 天才转为红色，这是由于八氢番茄红素合成的减少造成番茄红素和β-胡萝卜素的积累延迟，其 PSY1 蛋白的活性被抑制。与 GjPSY 的氨基酸序列比对表明，W180* 发生突变的氨基酸对应于GjPSY 的 W204，P192L 突变体的氨基酸相当于GjPSY 中的 P216，这两个氨基酸均在两个 DXXXD模体之间，且在多种植物的 PSY 中高度保守。
　　木薯中的两个PSY基因在不同组织中的表达也不相同，叶中PSY1和PSY2均有高水平的表达，在根和花药中的表达水平均较低，但根中PSY2的表达是PSY1的 10 倍。另外，木薯的PSY1可对高盐胁迫响，PSY2中的单碱基突变导致的单氨基酸突变(A191D)可使木薯根中的类胡萝卜素含量提高 20 倍。A191 氨基酸位于两个 DXXXD图 4 来自不同植物的 18 个 PSY 的亲缘关系图谱。节点上的数字为重复 1000 次的自展支持率(Bootstrap)。子叶和果实中GjPSY基因的转录水平等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析444 热带亚热带植物学报第21卷模体之间的较保守的区域。本研究中分析的来自12 种植物的 18 条 PSY 氨基酸序列中 A191 均为丙氨酸。GjPSY 的氨基酸序列与木薯 PSY2 的相似度为 76%，与 PSY1 相似度为 74%，所以更接近PSY2。但从以上与番茄和木薯的序列比对及表达分析还难以明确判断 GjPSY 的功能。
　　玉米、高梁、小麦和水稻各有 3 个PSY基因，都编码有功能的八氢番茄红素合成酶。小麦中的3 个PSY基因中，只有PSY1与面粉的黄色素含量有关，PSY2只获得了部分序列，PSY3的启动子区存在可应答脱落酸 ABA 的顺式作用元件。其PSY1的表达与籽粒中类胡萝卜素的积累正相关，PSY2则与叶中类胡萝卜素的合成相关，在叶中表达最多。PSY3在未受到胁迫的叶中的表达比PSY1和PSY2低，在根中稍多一点。在外源 ABA且受胁迫的根中，3 种PSY的表达均有增加，以PSY3的增加最多，即PSY3对 ABA 的反应远大于PSY1和PSY2。与小麦的比较分析也难以判断GjPSY的种类和作用。玉米的PSY1主要在叶片和胚乳中表达，并与胚乳中类胡萝卜素的积累呈正相关关系；其PSY2的表达则与光诱导的脱黄化过程正相关；PSY3在根和胚乳中大量表达，可被干旱、高盐和外源 ABA 处理所诱导。水稻胚乳中不含类胡萝卜素，3 种PSY基因在胚乳中都无表达；而在进行光合作用的组织中，3 种基因都有表达。
　　水稻的OsPSY1和OsPSY2在根和叶中的表达均高于OsPSY3，其中OsPSY1和OsPSY2均受光调控，OsPSY1表达最多。OsPSY3不被光诱导但在根中的表达可被高盐或干旱所诱导。通过分析水稻、玉米和拟南芥的PSY基因的结构及它们的启动子区，认为OsPSY1是单子叶和双子叶植物的古老PSY基因的遗存，OsPSY2和OsPSY3均是OsPSY1的平行同源基因。因此，我们推测GjPSY相当于玉米和水稻中的PSY1。
　　参考文献[1]　Machida K, Oyama K, Ishii M, et al. Studies of the constituentsof Gardenia species: II. Terpenoids from Gardeniae Fructus [J].Chem Pharm Bull, 2000, 48(5): 746–748.
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