【理学论文】紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立

   摘要：为建立紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)悬浮细胞培养体系，以紫茉莉无菌苗叶片诱导的愈伤组织为材料，筛选紫茉莉悬浮细胞的适宜培养体系。结果表明，紫茉莉愈伤组织在MS + 2,4-D 1 mg L–1+ KT 0.5 mg L–1的液体培养基中悬浮继代培养3 ~ 4次，能得到稳定的悬浮细胞系。培养基的 pH 值为 5.5 ~ 5.9，蔗糖浓度为 30 g L–1更适合悬浮细胞的生长。紫茉莉悬浮细胞的生长曲线大致呈 S 型。最佳继代培养时间是 10 d，培养液的体积为 40 mL 时，接种量为 7.5 mL，可以较好地保持悬浮细胞系。1 L培养液中可提取分泌蛋白(0.42 ± 0.15) g。这些有助于对悬浮细胞提取分泌蛋白的研究。
　　关键词：紫茉莉；悬浮细胞；悬浮培养；分泌蛋白
　1 材料和方法1.1材料供试紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)种子采自沈阳农业大学植物园。按照白玉等的方法诱导培养紫茉莉愈伤组织。取紫茉莉种子若干，冲洗剥皮后，用 75% 乙醇浸泡 8 min，0.1% 升汞消毒 10 min，无菌水冲洗 4 次、浸泡 1 h，剥掉内层种皮，接种于MS + NAA 0.1 mg L–1培养基中，在 25℃，光照强度为 12.5 ~ 25 μmol m–2s–1的条件下培养，获得无菌苗。将无菌苗叶片切成约 0.5 cm × 0.5 cm 的小块，接种于 MS + 2,4-D 1 mg L–1+ NAA 1 mg L–1+ KT1.5 mg L–1培养基上，在 25℃，光照强度为 12.5 ~25 μmol m–2s–1条件下培养。以上试验培养基的蔗糖浓度均为 30 g L–1，琼脂为 7 g L–1，pH 调至 5.8。
　　1.2紫茉莉悬浮细胞培养选取分散性较好、质地较疏松的愈伤组织，接种在 MS + 2,4-D 1 mg L–1+ KT 0.5 mg L–1的液体培养基中进行培养，每个 150 mL 的三角瓶中加入液体培养基 40 mL，投入约 2 g 的愈伤组织，培养温度为 25℃，摇床转速为 110 r min–1。培养初期每5 d 继代 1 次，每次继代时，将培养瓶静置几分钟后，倒掉 2/3 原培养液，然后更换新培养瓶，加入新的培养液。连续继代 3 ~ 4 次后，每隔 12 d 继代 1 次，所建立的细胞悬浮系生长迅速，分散性和均一性较好，颜色呈淡黄色，逐渐获得稳定的悬浮细胞系。
　　1.3不同pH和蔗糖浓度下的悬浮细胞培养蔗糖设置 5 个梯度浓度 , 分别为 10、20、30、40和 50gL–1，pH 设置 3 个梯度范围 ,分别为 5.0~ 5.4、5.5 ~ 5.9、6.0 ~ 6.4，配制成不同蔗糖浓度、pH 的液体培养基，对紫茉莉悬浮细胞进行培养。连续培养 12 d 后测定悬浮细胞增值系数，并观察生长状况，筛选合适的蔗糖浓度和 pH。
　　1.4悬浮细胞增殖系数的计算对悬浮培养初期(0 d)及连续培养 12 d 后的培养基进行取样，过滤出愈伤组织，再用干滤纸吸干，称重。每次实验 3 次重复，计算细胞的增值系数 ,增值系数 = (接种 12 d 后的愈伤组织质量 – 接种时的愈伤组织质量) / 接种时的愈伤组织质量。
　　1.5悬浮细胞生长曲线的测定从稳定的紫茉莉悬浮细胞系中取 5 mL 悬浮培养物，接入新鲜液体培养基中振荡培养，每隔 2 d取样 1 次，过滤出愈伤组织，再用滤纸吸干水分，称重，连续培养 12 d，每次实验 3 次重复。
　　1.6细胞计数从稳定的紫茉莉悬浮细胞系中取 5 mL 悬浮培养物，接入新鲜液体培养基中振荡培养，每隔 2 d 取1 mL 悬浮细胞液，滴于载玻片上，在显微镜下观察，采用血球计数板法对悬浮细胞计数，3 次重复，结果取平均值。
　　1.7分泌蛋白的提取检测收集继代培养 10 d 的悬浮细胞培养液 1 L，滤去愈伤组织，将滤液进行冻干浓缩后，在 4℃17000 ×g下离心 25 min，转移上清液；加入 4 倍体积的预冷 TCA-丙酮溶液(含 10% TCA、0.07% β-巯基乙醇)，充分混合后于–20℃放置过夜，再在4℃17000 ×g下离心 20 min，弃上清，沉淀加入预冷的80% 丙酮溶液(含 0.07% β-巯基乙醇)充分混合，相同条件离心后弃上清；重复 2 次，收集沉淀。沉淀物吹干后在 –80℃保存，双向电泳检测。
　　2 结果和分析2.1愈伤组织的诱导及悬浮细胞系的建立将分散性好、质地疏松的紫茉莉愈伤组织接入液体培养基后，新的愈伤组织不断生长，每隔 5 d 继代 1 次，在培养初期有褐化现象，经过 3 ~4 次继代以后悬浮细胞迅速增殖，细胞状态良好，分裂旺盛，分散性和均一性均良好，颜色呈淡黄色。
      2.2继代次数对细胞形态的影响在紫茉莉愈伤组织悬浮继代培养的初期，体系中悬浮细胞的形态、大小及数量随继代次数而变化。在第一次继代培养时，体系中大部分为成团的愈伤组织，颗粒较大，较混浊，在倒置显微镜下观察，细胞多数成团，聚拢紧密，保持较旺盛的分裂能力。当继代次数为 2 ~ 3 次时，体系中的细胞团颗粒大小、分散性及均一性较好，悬浮液颜色呈淡黄色，比较粘稠，在倒置显微镜下观察，分裂的细胞团增多，每个细胞团大多由 10 ~ 20 个单细胞组成。随着继代次数的逐渐增加，悬浮系的颗粒分布更加均匀，体系中的由 3 ~ 5 个单细胞组成的小细胞团及单细胞数量也随之增多，大多呈球形或椭球形(图 2: C，D)。
　　2.3 pH和蔗糖浓度对细胞生长的影响通过比较不同 pH 和蔗糖浓度对悬浮细胞增值系数的影响，选择合适的培养基 pH 和蔗糖浓度。紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立456 热带亚热带植物学报第21卷由表 1 可知，当培养基 pH 为 5.5 ~ 5.9 时，紫茉莉悬浮细胞的增值系数最大，细胞生长最旺盛，pH 高于或低于这一范围时，都不利于悬浮细胞生长。悬浮细胞的增值系数随蔗糖浓度的增加而增加，当蔗糖浓度达到 30 g L–1时，增殖系数达到最大，而当蔗糖浓度继续增大时，悬浮细胞增值系数却减小，蔗糖浓度达到 50 g L–1，增值系数急剧减小，说明细胞生长反而受到高浓度蔗糖的抑制。因此，当 pH 为5.5 ~ 5.9，蔗糖浓度为 30 g L–1时，更适合悬浮细胞的生长。在这个条件下，紫茉莉悬浮细胞更旺盛，不易褐化。
　　 2.4细胞生长曲线通过细胞计数绘制紫茉莉悬浮细胞的生长曲线。紫茉莉悬浮细胞系的生长曲线大致呈 S 型。紫茉莉悬浮细胞的整个生长周期可分为停滞期、对数生长期、平台期等 3 个特征时期。在 0 ~ 4 d 细胞数目增长不明显，生长缓慢，此时为停滞期；在 4 ~ 10 d 进入对数生长期，悬浮细胞状态良好，具有较高的生活力，细胞数目急剧增加；在10 ~ 12 d 进入平台期，细胞数量达到峰值之后增长减缓，这可能是由于随着培养时间的延长，培养基中的营养成分被大量消耗，细胞活性下降，代谢产物严重积累，大量衰败的细胞聚集在瓶壁上，不利于悬浮细胞系的生长。因此，紫茉莉细胞在悬浮培养的过程中最佳继代培养时间是 10 d。
　　2.5不同接种量对细胞生长的影响悬浮细胞的起始密度对于建立稳定的体系有重要影响，过高或过低均不利于建立稳定的再生体系，对细胞培养周期也有影响。分别从稳定的 40 mL 悬浮培养液中分别吸取 2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL 的悬浮细胞进行培养，接种量为 2.5 mL (即起始密度过低)时，悬浮细胞生物量增长十分缓慢，在 0 ~ 8 d 基本处于停滞状态，小细胞团和单细胞很难增殖，8 d 过后悬浮细胞才开始生长起来。悬浮细胞的生长量随着接种量的增加而增加，达到最大生物量所需的时间也随之缩短，当接种量为 5 mL 时，在 10 ~ 12 d 即达到最大的生物量；当接种量为 7.5 mL 时，在 8 ~ 10 d 悬浮细胞的生物量已接近峰值。而接种量为 10 mL (即起始密度过高)时，悬浮细胞在 0 ~ 4 d 快速增殖，悬浮培养体系能迅速获得较大的生物量，此时生物量呈对数增长趋势，4 d 之后，由于体系中的养份被消耗，细胞系营养不足而导致细胞增长缓慢，生物量变化不明显，且容易出现褐化。因此，本试验中当紫茉莉悬浮细胞体系的培养液体积为 40 mL 时，以 7.5 mL 的接种量为宜。
　　2.6分泌蛋白的提取检测从继代培养 10 d 的 1 L 悬浮细胞培养液中提接种量对悬浮细胞生物量的影响分泌蛋白，最终可获得(0.42 ± 0.15) g 的分泌蛋白。经双向电泳检测，这些分泌蛋白获得了较好的分离。
　　3 讨论植物悬浮细胞的形态、大小及数量均受继代培养次数影响。经过多次继代培养，细胞悬浮液通常由浑浊逐渐变澄清，愈伤组织由较大颗粒逐渐变小，细胞形状也由不规则变为规则的球形、椭球形。此时的悬浮细胞生长更旺盛，均一性好，能够建立稳定的悬浮细胞体系。培养基中适宜的 pH 值和蔗糖浓度有利于悬浮细胞的生长。一般认为 pH 能影响悬浮细胞的质膜透性、细胞呼吸代谢、多胺代谢和蛋白质合成等，以及生长调节物质进出细胞及其在胞内的存在方式，因而间接影响培养物生长、分化和物质积累。
　　蔗糖是植物细胞生长和代谢最适的碳源，适当增加蔗糖浓度可以增加细胞活力，为细胞的生长和代谢提供能量，促进细胞增殖和生长。同时，蔗糖是一种渗透调节剂，对细胞的代谢有重要影响。但当蔗糖浓度过高时，反而会抑制细胞生长，这可能是由于高浓度的蔗糖会导致培养液渗透压增大，使细胞失水引发质壁分离以及酶钝化失活等，从而影响细胞生长。
　　在细胞悬浮培养的初期，悬浮体系中营养物质充足，细胞数目稳定增长。继续培养，随着营养图 5 紫茉莉悬浮细胞分泌蛋白 2-DE 图谱等：紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立物质的消耗，以及细胞在新陈代谢过程中分泌一些有毒物质到培养液中，致使部分细胞开始衰老死亡。悬浮细胞初始接种量是悬浮培养中的一个重要指标，与悬浮细胞的生长状况联系紧密。初始密度过高或过低不仅会影响细胞培养周期，而且易使悬浮细胞发生褐化现象，不利于稳定细胞体系的建立。悬浮细胞需要达到一定的初始密度才能进行生长分裂，可能是由于细胞分裂的启动，需要细胞内某种条件因子达到一定的内源水平。在液体条件下细胞间仍然存在物质及信号的交换，起始培养的细胞密度过低时，来自相邻细胞的信号分子的量不能在短时间达到细胞生长的需求，因此抑制了细胞的进一步增殖。初始密度较高时，虽然细胞间物质及信号交换容易达到细胞分裂所需的内源水平，使细胞生长迅速启动，表现为细胞迟滞期缩短，但悬浮细胞的初始密度过高，细胞生长又会迅速消耗培养基中的大量养分，进而导致细胞过早衰老死亡。因此，选择既能使细胞生长获得最大的增长速率，又不会引起养分浪费的适宜接种量是悬浮细胞培养过程中一个重要的因素。
　　紫茉莉作为一种修复石油污染土壤的首选植物，提取其分泌蛋白、研究其耐胁迫的分子机制有重要意义。本研究结果与 Kim和陈莉等的相一致，证实长势良好、质地均一的悬浮细胞体系，可用于分泌蛋白的表达提取。因此，通过建立紫茉莉的细胞悬浮体系，并在细胞体系中进行有机污染物胁迫处理，可以获得紫茉莉的分泌型功能蛋白的差异表达，有助于揭示污染土壤生物修复植物紫茉莉耐受石油污染物及与根际微生物互作降解污染物的分子机制。本研究通过对紫茉莉愈伤组织进行液体悬浮培养，利用细胞计数、观察细胞形态、计算细胞生长周期、确定接种量等手段，成功建立了紫茉莉悬浮细胞培养体系。这些研究为提取悬浮细胞分泌蛋白、研究胁迫机制奠定了基础。
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