【医药学论文】microRNA101在子宫颈Hela细胞和Siha细胞中

1 研究对象

1.1 细胞株

购自上海细胞库的人宫颈癌细胞Hela , 人子宫颈鳞癌细胞Siha，人食管鳞癌细胞Eca109进行研究。

1.2 miR-101的mimics和inhibitor

miR-101的mimics和inhibitor由上海英骏生物技术有限公司设计并合成，并带有荧光标记。

同时还合成了mimics和inhibitor的阴性对照。

1.3 引物设计与合成

PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成

Real-time PCR引物探针序列如下表：
U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA
miRNAs通用Sense引物 GTGCAGGGTCCGAGGT
hsa-miR-101-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT
1.4 主要试剂
胎牛血清（FCS）: Gibico 公司，美国
胰蛋白酶酶：Gibico公司
Trizol: Invitrogen 公司，美国
DEPC: Amreseo 公司，美国
兔抗人β-tubulin 多克隆抗体:SantaCruz 公司，美国
RIPA裂解液：北京百泰克公司
EP管和离心管：Axygen公司，美国
Rnase: Invitrogen 公司，美国
DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司
Taq DNA聚合酶：Takara公司
其他试剂，如：氯仿、异丙醇、无水乙醇、甲醛等均为国产分析纯。
实时荧光定量PCR仪IQ5：BIO-rad 公司，美国
倒置显微镜：OLYMPUS 公司，日本
干燥箱：202-2型，上海市实验仪器总厂
电热恒温箱：DNp9082，上海精密实验设备有限公司
制冰机：SIM-F124 型，SANYO公司，日本
超纯水装置：Milli-Qplus 型，Millipore 公司，美国
台式低速离心机：TD5A-WS，上海湘仪离心机仪器有限公司
微型离心机:Mini-41c，珠海黑马医学仪器有限公司
立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-3011，上海博迅实业有限公司医疗设备厂
电子天平：赛多利斯公司，美国
高速离心机：5810R、5415D，Eppendorf 公司
2 内容与方法
2.11 复苏细胞及培养
2.1.2 细胞传代
2.1.3 细胞冻存
2.1.4 细胞接种
2.1.5 细胞计数
2.2 细胞转染步骤
转染前一天，每孔板的细胞弃去培养液，加入500ul的OPti-MEM，这样可以使细胞处于同步的饥饿状态。
用50ul DEPC 水重悬1OD的siRNA（mimics/ inhibitor 以及阴性对照的siRNA）,震荡混匀溶解。
(1)稀释1ul microRNA-101的mimics/ inhibitor于50ul OPti-MEM中，混匀。
(3) 将稀释后的mimics/ inhibitor和lipofectamine2000混匀，放置20min。
（1）将siRNA- lipofectamine2000 复合物每培养瓶加入10ul, 24孔细胞培养板每孔加入1ul, 96孔细胞培养板每孔加入0.5ul，
（3）24小时后弃去原来的培养液，换成含10%胎牛血清的培养液。
2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR, qRT –PCR）
导致RNA降解的最主要的物质是RNA酶,它的生物活性稳定并且可以广泛分布在灰尘中、各种实验器皿上、实验试剂中以及人体分泌的汗液唾液中。因此在进行提取RNA进行RNA分析技术的过程中最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染,控制其对RNA的降解作用,实验过程中应该采取以下措施:
（2）Eppendorf管和枪头等采用一次性RNase-free的塑料制品。玻
（3）溶液配置: 配置的各种溶液应加入0.1%DEPC在37℃处理12-16h,然后高
2.3.1 细胞总RNA的提取
（2）将吹打完的悬浮液移入1.5ml 离心管中，用移液枪吹打40下至完全混匀，冰上放置5 min。
（4）这时离心完的液体已经分层，调50ul的移液枪慢慢轻轻吸取上清液至另个一1.5ml无菌离心管中并做好标记，大概移400ul左右。
（6）弃去上清，在离心管底部可以看见少许白色沉淀，即为RNA 样品，然后用70%乙醇1000ul漂洗一次，4℃ 7500 rpm 离心5min，弃去上清，剩下的液体拿1ul小枪慢慢将其洗干净，在通风橱室温晾干。
2.3.2 注意事项:
Trizol的量太少,可以再补加Trizol。
2.3.3 逆转录反应合成cDNA
2.4 MTT法
将处于对数生长期的Hela, Siha, Eca109细胞以每孔103-104个细胞均匀的接种于96孔细胞培养板中，每孔体积200ul, 四周边缘用无菌PBS 填充。
（1）阴性对照组和上调实验组，下调实验组按每孔分别用0.5ul的阴性siRNA ,0.5ul mimics, 0.5ul inhibitor加入25ul OPti-MEM的量加入至离心管中, 正常实验组直接加25ul OPti-MEM。
（3）室温孵育5min。
（5）将RNA- lipofectamine2000 复合物以每孔30ul均匀滴入各组转染孔再各加入170ul无血清无抗生素的培养液，24小时后弃去原来的培养液换成含10%胎牛血清的培养液放入细胞培养箱继续培养。
（7）在490nm 波长下用酶标仪测定各孔吸光度值，记录结果，绘制生长曲线并计算细胞的生长抑制率。
(1) 应选择适当的细胞接种浓度和培养时间，浓度不易过多，细胞代数不易超过2代。
（3） 设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜）。
（5）培养过程中48h应该换液一次，因为100ul的培养液对于104-105次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响实验结果。
（7）判断污染。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性极大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。
2.5 细胞凋亡
  （2）24小时后，将阴性对照组，正常组，上调实验组，下调实验组中培养瓶里的细胞消化下来，1000rpm 离心5min，弃去上清液，加入PBS后再次离心，之后将细胞收集于1.5ml的离心管中。
2.5.2 注意事项：
(2）特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法可以先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。
（4）必须设置阴性对照和补偿对照（分别转染）。
（1）取对数生长期的细胞，以3×104个细胞每孔的细胞悬液均匀接种于24孔细胞培养板，置于37℃，5%CO2孵育箱内孵育。
（3）观察24孔细胞培养板中细胞的生长密度，直到到达80%-90%融合。
（5）PBS洗涤一次，加入新的培养液。
2.7 免疫组化
（2）24h 后观察细胞生长状态并进行转染，实验分组同前，每组设三个复孔。
（4）4%多聚甲醛处理（室温）20min。
（6）3% H2O2处理细胞15min。
（8）将一抗用PBS按1：100稀释，每孔加入一抗50ul，阴性对照孔用PBS代替一抗。然后4℃冰箱内过夜。
（10）二抗（COX-2或EZH2）孵育，37℃，20min。
（12）DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂按500ul 蒸馏水中各加4ul，混匀，在镜下观察显色情况，在没有背景的条件下可继续显色，一般在2-10min。