【医药学论文】香烟烟雾提取物对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移的影响及其机制探讨

 【摘要】 目的 探讨香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE） 对大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell ，VSMC）迁移的影响，并对其可能机制进行初步探讨。方法 体外培养大鼠VSMC，并分为空白对照组及CSE组，其中CSE组给予5％ CSE处理24小时，应用Transwell方法检测两组VSMC的迁移能力；应用RT-PCR 和 Western blot 方法检测两组骨桥蛋白（osteopontin，OPN ）表达水平。结果 CSE组VSMC迁移能力较对照组明显增强（P ＜ 0.01）；同时CSE组OPNmRNA及蛋白表达均较对照组明显升高（P ＜ 0.01）。结论 CSE能够促进大鼠VSMC的迁移，且其机制可能与上调OPN表达有关。

血管重塑是动脉粥样硬化、高血压等血管相关疾病的共同病理生理过程，而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 向内膜下增殖与迁移是血管重塑的重要病理基础 [1-3]。

材料与方法
1.细胞核试剂 购自美国肯塔基大学烟草健康研究所生产的烟草研究用香烟（3R4F）。大鼠A10主动脉VSMC株购自美国ATCC细胞库。胎牛血清购自杭州四季青公司。RT-PCR逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。OPN兔抗大鼠多克隆抗体、α–tubulin兔抗大鼠多克隆抗体购自Santa Cruz公司。Transwell购自Corning公司。
1．细胞培养 VSMC采用DMEM培养基培养（含10﹪的FBS），细胞在5％C02、37℃、饱和湿度条件下培养。每2～3天予以换液一次。待细胞汇合度达到80～90％时，予以传代。
3．Transwell 法检测VSMC的迁移能力 应用0.25%的胰酶消化细胞，10%无抗生素DMEM中止消化，离心800rpm，5min，弃上清，无血清无抗生素DMEM 1ml重悬细胞（5×105/ml）。将Transwell下室中加入10% DMEM 600μl，上室置于下室中，取100μl细胞悬液加入上室。37℃、5%CO2饱和湿度培养箱孵育24h后，将上室取出，用沾有PBS的棉签擦掉上室中的细胞，对迁移至滤膜外表面的细胞，用4℃预冷95%酒精固定30min，再用苏木素染色15min，置于1%盐酸酒精分化3s。自来水冲洗15min。将上室的滤膜过夜晾干，用刀片切下，在载玻片上滴加中性树胶半滴，下室面朝上平铺于载玻片上，再滴半滴中性树胶于膜上，盖玻片封片保存。显微镜下照相并计数迁移到滤膜下室面的VSMC，每个样本计数5个高倍视野（×200）的穿膜细胞数，取平均值，测定VSMC迁移抑制率。
5．Western blot 检测OPN蛋白表达　加入RIPA裂解液（50mmol/L tris-HCI，PH7.5；1mmol/L PMSF，0.lmmol/L， 50mmol/L NaCI， 1mmol/L EDTA， NaVO4，10mg/ml aprotinin， 10mg/ml LeuPePtin）200μl裂解细胞，将蛋白浓度调至5μg/μl。以每孔50μg 的含量加样，SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 电泳分离。转膜于PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 1 h。加入（1:500稀释的OPN兔抗大鼠多克隆抗体，α–tubulin兔抗大鼠多克隆抗体）4℃孵育过夜。TTBs 洗膜 5 min×3，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TTBS洗膜5min×2，TBs洗膜5min×l，加DAB液显色5-10min。凝胶成像分析系统成像。
所有数据均用 SPSS13.0 软件进行统计学分析，不同组间参数比较用One-way ANOVA 分析，两两比较采用LSD方法，P＜0.05有统计学意义。
一、CSE对VSMC迁移的影响
二、CSE对VSMC中OPN mRNA表达的影响
三、CSE对VSMC中POPN蛋白表达的影响
讨 论
研究发现，血管重塑是血管相关疾病的共同病理生理过程。血管重塑是指血管壁在局部生长因子、血管活性物质及血流动力学等的共同作用下，管壁结构发生改变的主动过程，其主要特征是内皮细胞功能紊乱、VSMC的增殖和迁移以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积。其中，血管中膜平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理基础之一。
本研究通过应用Transwell方法检测CSE处理过的大鼠A10主动脉VSMC的迁移能力，明确CSE对VSMC迁移的影响。结果显示，与未处理组比较，CSE组VSMC迁移能力明显增强，表明CSE能够显著促进VSMC的迁移，并进而介导血管重塑。在此基础上，我们拟对其机制进行进一步探讨。
为此，本课题组分别应用RT-PCR及Western blot方法检测了CSE处理后的VSMC中OPNmRNA以及蛋白含量的变化，进而对CSE促进VSMC迁移的机制进行初步探讨。结果显示，CSE组OPN mRNA和蛋白水平的表达均较对照组明显增强。该结果表明CSE可通过上调OPN表达从而促进VSMC的迁移。