解放军文职招聘考试用做固定剂的试剂

 用做固定剂的试剂

1、单一固定剂：

仅由一种化学物质加水溶解后用以固定标本的固定液叫单一固定液。常用单一固定试剂有甲醛，洒精，冰醋酸，苦味酸，重铬酸钾，饿酸，氧化汞 ，丙酮等。除福尔马林，酒精和丙酮常用作单一固定剂外，其它多作混合液中的一种成分。

 

  甲醛formaldeloyde (H•CHO)

  甲醛是一种气体，约有40%重量溶于水。这是一种还原剂，颇易挥发，这种饱和溶液称为甲醛溶液；其商品名叫福尔马林。

10%福尔马林的组成系；

甲醛溶液（福尔马林）     10ml

    水             90 ml

甲醛是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好别的标本保存液。经它固定的标本，可适应一些特殊染色。它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织 缩轻微，硬性大于酒精。

福尔马林主要是由甲醛的聚合形式构成，然而聚合形式的固定效果低于单体形式构成的10%福尔马林，为阻止在放置一定时间的重聚作用，一般将溶液的PH值调节至中性或偏碱性。

甲醛与蛋白质是在分子间的交联上起反应，最终产生一种不溶性产物。它经过络合交联，使蛋白质固定，能较好地保存脂类；对肝糖也有固定作用，但必须及时固定及时处理，以免产生水解。

甲醛当长期贮存，特别于寒冷气候下，自行分解，可变混浊，有白色沉淀物，这种沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一种聚合形式（加热可重新分解成甲醛）。商品福尔马林用甲醇阻止聚合作用。有时由于溶液不纯或甲醛氧化产生的甲酸成分使溶液呈酸性，酸性的甲醛溶液使标本嗜染酸性、严重时可导致细胞核的嗜酸性染色。因此，在备用的甲醛中宜放入小量的碳酸镁或碳酸钠作为中和剂。如果每100毫升的福尔马林固定液中加入5ml的吡啶，则可调整PH为7。不过，这些方法不能永久保持其PH值；欲望使其长期保持中性，则需以磷酸缓冲液作溶剂进行配制。其配制方法如下：

10%福尔马林 1000ml

磷酸二氢钠（NaH2PO4） 4g

磷酸氢二钠（Na2HPO4） 6.5g

固定小的组织块数小时即可达到固定要求。如需要快速固定时，可加温到70～80℃，经过10分钟即可达到固定要求。在甲醛溶液中短时固定的标本，冲洗时间在10分钟至2小时即可，但固定时间较长的标本需要较长时间的流水冲洗。一般要冲洗24小时，甚至延长48小时，否则，由于甲酸的沉淀将会影响染色的结果。

甲醛能保存脂肪和类脂体，对染色体，线粒体，高尔基体，具有良好的固定作用。

经甲醛固定的陈旧组织，尤以多血的肝脾组织内常可出现棕黑色的福尔马林色素颗粒，这种色素不溶于水，酒精及丙酮等，如欲与含铁血黄素加以区别，可用普鲁士兰反应进行鉴别。福尔马林色素不含有铁，因此，福尔马林色素呈阴性反应，用中性或微碱性福尔马林固定的效果能显著增加对铁离子的检出速度且可完全避免福尔马林色素的形成。此外也可以使用其他试剂以浸洗方法除去福尔马林色素的沉淀，如：

（1）苦味酸饱和酒精（90%）溶液浸洗30分钟后经70%酒精再水洗后进行染色。

（2）什端氏（Schriade）法：

70%酒精 200ml

28%氨水 1ml

将石蜡切片在脱蜡以后放于上述液体中30分钟，再用流水冲洗，而后染色。若甲醛产生的色素沉淀仍未被其洗去，则可在Schriade氏液中延长时间。此法并不损害组织。

(3)费罗氏（Verocay）法:

80%酒精 100ml

1%KOH   1ml

将切片在脱蜡至80%酒精后，浸入上液10分钟，再流水冲洗5分钟，入80%酒精之后水洗染色。

福尔马林固定的标本，经酒精脱水收缩较大，是其缺点。

 

酒精（C2H5OH）

可单独用作固定液；亦可作混合固定液，因为酒精（乙醇）是一种还原剂，所以不可与铬酸，重铬酸钾或锇酸等氧化剂相混合使用。在氧量不足时酒精易氧化成乙醛；氧量充足则能生成酯酸，所以在正常情况下，酒精是偏酸性试剂。

酒精为常用的有机溶剂，能溶解多种有机物，高浓度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，对肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖经酒精固定成水溶性状态，因此，经酒精固定的标本如果固定后用水洗涤，则核着色欠佳，肝糖也将被水解。作为一种脂溶剂，浓度在50%以上的酒精可溶解脂肪和类酯体，因此，对脂类的证明，高尔基氏体，线粒体等染色不宜使用酒精作固定剂。

酒精还可溶解血红蛋白和损害多数其他色素，因此，如果证明组织蛋白的色素时也不宜以酒精作为固定剂。

浓酒精有较大的收缩力，被它固定的组织收缩显著，表面发硬，因而酒精较难渗入到组织中去，组织必须用酒精固定时宜先用80%的酒精固定数小时，然后再换95%酒精，这样可以避免组织过度收缩，因此它的穿透力缓慢且与组织长期接触能使之硬化，如需要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用100%酒精固定。

酒精既有固定作用，又有脱水作用，经酒精固定的标本不需洗涤，可用较高浓度酒精直接进行脱水，也可暂存于70%酒精中。

 

醋酸（CH3COOH）

纯醋酸为无色，具有强烈刺激性的酸性液体，温度低于17℃时呈固体状，形成冰样结晶体。所以，一般称为冰醋酸。

醋酸因使胶原纤维肿胀，故不能单独使用；但在混合固定液中有抗其它试剂使细胞皱缩的作用。因此，醋酸常同酒精配制成为混合固定液来抵消经过固定所引起组织的高度收缩和硬化的作用。

醋酸可与水，酒精等溶剂相混合。一般使用浓度为0.3～5%，以5%为备用液。用醋酸固定后的组织不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中。醋酸的渗透性很强，一般较小的组织块只须1小时即可。

醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色质固定很快，是染色质良好的固定液。对蛋白质具有保存作用，对脂类、糖不产生影响，高浓度醋酸则可溶解脂肪及类脂，并使线粒体和高尔基体被破坏或变形。所以，一般配制含醋酸的混合液时，其浓度都不超过5%。

 

苦味酸（C6H2(NO2)3OH）

苦味酸是一种具毒性的黄色结晶体，味苦，在空气中干燥时有爆炸性，故需保湿保存，最好是储存在一层水下。一般情况下，制片室将苦味酸制成饱和溶液作为常备用液，通常固定的浓度是饱和液，其饱和度为0.9%~1.2%。苦味酸溶于酒精，二甲苯，固定后的组织经酒精脱水即可。苦味酸也是一种良好的组织染色剂，经苦味酸固定剂固定的组织作三色染色可使颜色对比鲜艳。

苦味酸能沉淀一切蛋白质，并与其结合形成苦味酸盐，遇水时，其中有的部分可溶与水，因此在一般情况下，组织经苦味酸或含有苦味酸的固定剂固定后，这种水溶性苦味酸盐在与水接触前需先经酒精处理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗，在酒精内加上少量碳酸锂或氨水即可被洗去。或者是不经水洗，直接投入70%酒精脱水。在脱水过程中，苦味酸可被各级酒精溶解洗去。即使不能全部洗去，亦不妨碍染色，脱水酒精虽被染黄，但亦不失其脱水效果。

通常苦味酸沉淀红细胞，可移走铁离子，特别是仅少量存在时可使RNA抵抗核糖核酸酶的消化。

 

重铬酸钾(K2Cr207)

  重铬酸钾为一种橘红色有毒性的块状结晶体，溶于水，不溶于酒精，为一种强氧化剂。所以其水溶液不应与酒精，福尔马林等还原剂相混合使用。在某些情况下，同福尔马林混合固定标本时，只能在使用前相混合，过久即失去固定作用。经重铬酸钾固定后的组织应及时进行水洗脱水，否则标本变硬脆化，不易制成切片。如不能当即制作切片，可将标本保存于福尔马林液内。

重铬酸钾对蛋白质的结合作用像福尔马林一样，固定胞浆不易引起沉淀作用。但在溶液中加入醋酸，PH为3.75时，会使染色质和细胞浆硬化，使之产生铬酸，才能使蛋白质呈网状沉淀。重铬酸钾对细胞质，染色质固定良好，但染色质则被溶解。未酸化的重铬酸钾虽不能沉淀蛋白质，但可使蛋白质变为不溶性，还可以保护磷脂类，亦能固定类脂物，使其不溶解于脂溶剂。因此，可以固定高尔基氏体和线粒体。

重铬酸钾不是糖的固定液，用重铬酸钾（或铬酸）固定的组织几乎完全不会发生收缩，但经酒精脱水时，则收缩明显。所以在脱水之前，组织需用流水冲洗16－12小时。如把含铬组织直接转移到酒精内，会形成一种非溶性低氧化物而不易除去。

重铬酸钾有溶解染色质的缺点，一般备用液为5％水溶液，固定液使用浓度为1％－3％水溶液。

 

 

铬酸（CrO3）

为暗红色或带暗紫色的块状结晶，具有强酸性及腐蚀性，剧毒，易潮解，为强氧化剂，应置于暗处。它是Orth氏液或ZenRer氏液等复合固定剂中的一种成分，不应同酒精、福尔马林等还原剂混合使用。铬酸与乙醇，乙醚少许接触即可引起爆炸。

铬酸可沉淀所有的蛋白质，使不溶于水，并可保存糖类。铬酸水解DNA系将其戊糖转变为一种醛；亦可将糖类转变为醛。因此DNA和糖类不需经过常规PAS或Feulgen反应的预先处理即与Schiff试剂呈阳性染色。

铬酸的渗透力较低，对标本收缩轻微，经铬酸固定剂固定的组织像用重铬酸钾固定一样需彻底水洗，将组织中铬酸全部洗去，否则在脱水过程中，铬酸与酒精作用生成氧化铬的沉淀，使组织脆化，且不易于组织的着色。铬酸适合固定的浓度为0.5%～1%。

 

四氧化锇（OsO4）

为微黄色结晶，通常密装于安瓿内出售，为强氧化剂，一般认为它使未饱和键氧化。对饱和脂肪不起反应，未饱和脂类可还原OsO4，易氧化为黑色氢氧化物，溶液呈中性，挥发性强，在操作四氧化锇时应小心，因其气体有刺激性，会引起结膜炎。遇热和光时易还原，故应贮于冷暗处。平时溶液密闭有色瓶中，并置于冰箱内。

四氧化锇是脂肪和类脂质的固定液，用以显示脂类（例如髓脂类）。能使单个细胞或小组织的微细构造得以极好地保存，因此几乎是用于电子显微术最佳固定剂。组织经固定后，脂肪，类脂呈黑色，微溶于二甲苯及酒精，脱水后最好以苯作透明剂。

四氧化锇的渗透力弱。组织块如过2－3厘米厚度则穿透不良和不均。所有含四氧化锇固定剂的固定作用皆很不均匀；固定不良的组织切片表现周围有一圈过度固定的暗色区带；中心为固定不足致使细胞微细结构不清的区域。有些成分变暗是由于无色的OsO4转变为黑色水合物OsO4•5H2O形式。

四氧化锇常与铬酸，醋酸，重铬酸钾等混合使用，固定后的组织需经流水冲洗，否则在脱水酒精中易被还原产生沉淀，不利于核着色，在每10毫升溶液中内加入1滴饱和氯化汞水溶液有助于制止还原作用。

 

氯化汞（又名升汞或二氯化汞HgCL2）

氯化汞为白色粉末或针状结晶，后者为化学纯品，易升华，能溶于水和酒精。一般固定用其饱和溶液。

氯化汞是一种能迅速透入并使组织硬化的蛋白沉淀剂。通常像别的金属离子那样，它与蛋白质的酸基以及核蛋白的磷酸基相结合，亦特异地与氢硫基起反应。因而经Hg固定后的蛋白质不溶于水，大多数蛋白反应可被利用。可惜，它的透入速度于最初几毫米后就急骤降低，因此组织块厚度如超过5毫米常使外围过度固定致坚硬而中心固定不足仍柔软，只宜固定薄片组织。由于此缺点加之使组织收缩剧烈，很少单独使用；当与拮抗此缺点的试剂如醋酸，福尔马林，重铬酸钾等结合使用时，氯化汞仍是很多优良常规固定剂的一种成分。用氯化汞固定的组织使染色特别对胞浆着色比较鲜丽。

凡用含氯化汞的固定剂固定的组织如超过规定时间会使组织过度硬化，而难切薄片。组织内常存有汞盐，切片时能损伤切片刀，所以在脱水前应予以洗去。常用方法是用70%酒精加入少量碘（0.5%）浸洗，再进行充分的冲洗或以70%酒精洗后进行脱水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗数分钟，再以5%硫代硫酸钠漂洗，水洗后进行染色。

氯化汞常备溶液为饱和（约7%）水溶液，固定用浓度常为5%水溶液。用升汞饱和液固定组织时，临时须加5%冰醋酸。固定2－3mm厚的组织块须经6－18小时，然后用水洗24小时，再保存于80%酒精中。

氯化汞腐蚀金属，混有此试剂的固定液不能使用金属容器盛装或用金属镊子夹持。氯化汞有剧毒，应妥善保管。

固定剂的选择取决于研究工作当时和下一步的需要，在选择混合固定剂时，应注意各种试剂的平衡，如使组织收缩的试剂可配以使组织膨胀的试剂，渗透力弱的可与渗透力强的混合使用。但是，氧化剂原则上不与还原剂混用，如需要时，只能在使用前临时混合。一种混合固定剂内不宜有两种以上的盐类，以免产生复盐影响对组织的固定，如氧化纳和氯化钠同时应用时，常将氯化钠改用硫酸钠。技术工作者和病理工作者都应了解各种固定剂的性能。固定液的选择恰当，才能获得满意的制片结果。

混合固定液的种类很多，本章内所述的固定剂皆是较常用的，特殊染色所需的固定剂皆列在相应的标题下。

Miiller氏液

配方：重铬酸钾       2.5g

    硫酸钠         1.0g

    蒸馏水加至       100ml

此液固定作用缓慢，但颇均匀，收缩亦小。多用于媒染和硬化神经组织，在这种固定溶液中，重铬酸钾未经酸化，所以对染色质无固定作用。不适用于一般细胞学染色。除用于骨骼标本外，此液是一种不常用的固定剂。固定时间数天至数周，在固定过程中，需要每日更换新液并置暗处，固定后的组织用流水冲洗，再放入酒精中脱水。

 

Orth氏液（Mullr氏液＋福尔马林）

配方：重铬酸钾　　　 2.5g

    硫酸钠       1.0g

福尔马林     10ml

蒸馏水   加至 100ml

一般以Mullr氏液为备用液，用前以9份Mullr氏液加1份福尔马林混合而成，因为重铬酸钾是氧化剂，福尔马林为还原剂，混合后久放即失去固定作用。

固定0.5厘米的标本块约需3－4日，每日需更换新液，标本固定后要充分水洗，然后进行脱水包埋。如固定过久，标本变脆，颜色由棕黄转变为黑色，则不能制作切片，标本经固定后如不能及时制片时，应将标本保存于福尔马林内或70%酒精中。

Orth氏液对染色质，线粒体有较好的固定效果。硫酸钠在固定液中有助于渗透作用，在一般情况下，可省去不用。

 

Zenker氏液（以Muller液为基液加入氯化汞在临用前再加醋酸混合而成）

配方：重铬酸钾         2.5g

    硫酸钠           1.0g

    氯化汞           5.0g

    蒸馏水     加至   100ml

    冰醋酸（临用时加入） 5ml

  Muller液加入醋酸后则不能贮存，未加醋酸的溶液（ZenRer氏原液）可保存较久。此液加入冰醋酸后，与重铬酸钾作用生成铬酸，是蛋白质的良好固定剂，其穿透力迅速而均匀硬化组织能力强，经它固定后的标本利于盐基性染色剂着色，胞核和胞浆染色颇为清晰，是一种优良的常规固定剂。

  Zenker氏固定液中含有两种蛋白质和三种染色质的固定剂：

 

所以Zenker氏液在组织学和病理学方面均较广泛使用，固定作用通常于12小时内完成。固定薄组织块2－4毫米时，固定12－14小时，然后用流水冲洗过夜（以除去多余的铬化物，汞色素须用碘来脱除）后进行脱水，或保存于80%酒精中。

 

Heely氏液

Heely氏液将Zenker氏液中的醋酸以福尔马林替代，并名之为Helly氏液。液中重铬酸钾未经酸化，对细胞质固定较好，对造血系统（骨、髓、脾、肝）等为一良好固定液。用于结缔组织染色效果也好。

配方：重铬酸钾       2.5g

    硫酸钠         1.0g

    氯化汞         5.8g

    蒸馏水   加至   100ml

    临用前加福尔马林   5ml

此液配好后24小时内有效，组织固定12－24小时后，流水冲洗，脱水。

 

Bouin氏固定液

配方：苦味酸饱和水溶液       75ml

    福尔马林（40%甲醛液）   25ml

    冰醋酸             5ml

  此固定液保存性良好，渗透速度快，穿透力迅速而均匀，且很少引起收缩，不使组织变硬和变脆，固定后的组织用三色染色法着色鲜艳绚丽，过量苦味酸使组织呈黄色，但并不妨碍染色，毋须洗净除去。

此液也是皮肤组织较好的固定液，它可以软化表皮不使其变硬变脆。利于切片，对蛋白质核酸有较好的固定作用，一般固定时间为数小时至一日。

 

Carrnoy氏固定液

配方：无水酒精       60ml

    氯仿         30ml

    冰醋酸       10ml

此液穿透力非常块、固定力强，对核固定良好，并可保存糖原也用于糖类的固定。于脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的固定。一般组织固定2－3小时后即可直接投入95%酒精和纯酒精中进行脱水，因此也可作快速固定的固定剂，厚度2－9毫米的小块组织仅需15分钟即可，外检胸腹水经过离心沉淀后，将沉淀物用Carrnoy氏液固定可制作石蜡切片。

 

  醋酸－酒精－福尔马林混合固定液

配方：福尔马林     10ml

    冰醋酸       5ml

    70%酒精     85ml

  这种混合固定液通常简称“AAF”固定液。使用较广泛，配制时一般可以酒精作为溶剂，然后加入福尔马林，醋酸。酒精可因组织种类不同而采用不同的浓度，在常规切片中，我们常采用浓度为95%酒精。

  此液对糖原的固定佳良，就是说在蛋白质成分完全固定之前可以防止糖类溶解，加入醋酸以保证蛋白质的固定，由于酒精和福尔马林二者皆为迅速穿透的试剂，这是一种相当好的快速固定剂，对临床外检工作特别有利，福尔马林对组织染色效果较好，醋酸可以防止酒精而引起的收缩。常温下，5毫米厚的组织固定4小时即可，加温（60℃）条件下，一般组织半小时内可固定良好，固定后组织直接放入95%酒精中脱水。

AAF固定液的缺点是组织固定后对细胞膜上的蛋白质和细胞内的某些结构有一定破坏作用，而对免疫组织化学染色有一定影响（详见免疫组织化学技术一章）。

 

其它常用固定液配方

10%甲醛生理盐水液

配方：福尔马林     100ml

    氯化钠       9.0g

蒸馏水       900ml

 

  Gendre液

配方：苦味酸饱和于95%酒精溶液     80ml

    福尔马林               15ml

    冰醋酸                 5ml

用此液在室温下3－4小时即可使糖原固定良好。

 

缓冲福尔马林液

配方：福尔马林                   10ml

    磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）       0.4g

    磷酸氢二钠（Na2HPO4）           0.65g

    蒸馏水                     100ml

  缓冲福尔马林固定剂具有能较好地保存细胞结构和某些细微结构，适于免疫组织化学染色和电镜观察，并且可较长时间保存组织（半年至一年）而又不影响制片和染色。是近年来越来越受到重视的固定剂。