【医药学论文】益气养阴方对肺间质纤维化大鼠模型TNFaTGFβ1I

实验前7天将购入的60只健康雄性SD大鼠适应性喂养于实验环境中,室温保持在20℃一25℃。然后将其随机分为正常组、模型组、中药组、激素组、中药+激素组5组,每组各12只。
造模后第28天,开始灌胃给药,连续给药28天,给药剂量由成人每日常规服药量换算而成。
②模型组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；
④激素组：将配制好的浓度为35%的醋酸泼尼松溶液予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；
以上各组大鼠均置于相同实验环境下饲养,室温保持在20℃一25℃,自由进食,饮水,于灌胃后第14、28天分批处死。
观察并记录各组大鼠饮食、饮水、皮毛、精神状况、二便、体重以及死亡情况等。

(1)肺组织形态学观察
断头处死大鼠后,肉眼观察分离出的完整肺组织外观形态。
将固定好的大鼠左肺下叶行HE染色及Masson染色观察肺组织形态学改变。
①取材,不能太大太厚,最好为24×24×2mm；
③切片,厚度5～10um间,厚薄均匀,无皱褶无刀痕；
⑤水洗；
⑦分化；
⑨伊红染色10－20秒；
Masson染色法：
②梯度入水：95%、70%、30%乙醇各漂洗2分钟,蒸馏水2分钟；
④于蒸馏水润湿玻片30-60秒；
⑥R2浆染液染色1分钟秒左右,倒丢,冲洗液冲洗30秒左右；(R2染色时间不宜太长否则可导致胞浆着色过深,使R3褪色效果不佳)
⑧用R4蓝色复染液复染5分钟左右,倒丢,然后用无水乙醇冲洗。
(2)原位杂交法检测肺组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达
①常规脱水、浸蜡、包埋。冰冻后切片,切片厚度6-8μm；
③石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗涤3次；
⑤后固定：此为关键步骤,待胃蛋白酶消化好后再用配制而成的固定液{1%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC}在室温下固定10分钟,蒸馏水冲洗3次。
⑦杂交：每张切片滴加20μl杂交液,并盖上原位杂交专用盖玻片,然后连同湿盒放入42℃恒温箱内过夜；
⑨滴加封闭液：滴加后放入37℃恒温箱30分钟,甩去多余液体,不洗；
滴加SABC：滴加后放入37℃恒温箱20分钟。原位杂交用PBS洗涤5分钟×3次；
二氨基联苯胺(DAB)显色：DAB显色试剂盒-取用1ml蒸馏水,往里加入显色剂Ａ,Ｂ,C各一滴,混匀后滴加在切片上,室温显色10分钟,充分水洗；
在高清晰光镜下行阳性细胞率检测[36]:在每个切片上随机取5个视野,镜下观察,胞质中有棕黄色颗粒即为阳性,计算出阳性着色面积,然后利用单位面积内的总细胞数通过计算得出其中的阳性细胞数,再将5个视野平均,可以求出切片中阳性细胞比例,最后用阳性细胞的百分率%来表示TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达。
0.05)；给药后第28d中药组与激素组体重增长高于模型组,且有显著性差异(P< 0.05)；中药+激素组体重略高于模型组,但无显著性差异(P>0.05)。
0.05)。

肺指数即肺脏总湿质量与实验后体质量之比[37],它可以衡量肺组织纤维化的程度。从公式可以看出,肺指数的大小与肺脏总湿质量成正比,所以各种原因导致的肺脏总湿质量增加均可使肺指数升高。