【医学论文】象耳豆根结线虫两个新基因（MeActin和MeHsp70）

（MeActin和MeHsp70）的克隆与特性研究
（1）MeActin基因全长cDNA序列为1298bp，包含一个全长1125bp的开放阅读框ORF，编码375个氨基酸，起始密码子在82位，终止密码子在1207位（GenBank 登录号KF534787），与已知的其它物种的Actin具有高度的保守性，与马铃薯腐烂茎线虫D. destructorto和松才线虫B. xylophilus Actin的同源性分别为99.20%和98.67%，与秀丽隐杆线虫C. elegans、人类H. sapiens相似性分别达到98.67%和97.33%。系统发育分析表明，MeActin可能是β-Actin，同时也发现了MeActin与人类的胞质Actin（β-Actin）更相似。MeActin基因的分离为M. enterolobii其它基因的表达和调控研究提供了内参基因。
关键词：象耳豆根结线虫；MeActin; MeHsp70；克隆；表达

1象耳豆根结线虫研究进展
2 肌动蛋白简介
3 植物寄生线虫Hsp70研究进展
3.1 Hsp70家族的分类
3.2 Hsp70的结构及其生物学功能
Hsp70在细胞内充当分子伴侣的角色，是众多学者最为关注和开展深度研究的一类热激蛋白[26]，它广泛分布于所有原核生物和真核生物的细胞内，广泛参与细胞的各种生理活动，属于非特异性的细胞保护蛋白的一种，对维持肽链正确折叠与伸展和调节蛋白内环境稳定具有非常重要的作用。
在高温、低温、干旱等非生物因素胁迫下，Hsp70还能够对生物耐受性加以调节的。王枫等通过硫酸镉诱导K562细胞的Hsp70高表达，并利用RT- PCR对 Hsp70 的mRNA水平进行检测，结果是细胞作用1h 后Hsp70 的mRNA 水平显著上升，且Hsp70的mRNA水平与细胞耐热能力成正相关[34]。同时，Hsp与耐冷性的直接关系已被Collins等[35]证实。
3.3植物寄生线虫Hsp70的研究
3.4展望
植物寄生线虫对高温及其它逆境因素胁迫的响应是一个多因子控制的复杂过程，对其抗逆胁迫如耐热性研究不能单纯寄希望于某种蛋白或某个基因的特性和功能分析，应结合其它相关研究综合地进行探讨，全面认识和解析植物寄生线虫的抗逆生理。况且，植物寄生线虫Hsp70基因的表达与调控机制尚未得到广泛而深入研究。
最近研究结果显示Hsps具有"变异缓冲器"的功能，与Zhu[44]提出的"演化能力分级制约假说"整合了分子和发育遗传学成果的内涵，有利于外延现代进化理论，使Hsp70可能成为物种进化研究新工具。
4 研究目的与意义
要深入研究M. enterolobii其它功能基因，内标参照是必不可少的。采用RACE-PCR技术成功克隆了M. enterolobii肌动蛋白基因Actin的全长cDNA序列，为进一步开展研究其功能基因的表达和调控奠定基础。
1材料与方法
M. enterolobii原始种群来源于海南省农业科学院植保所植物线虫保存圃。
1.4.1象耳豆根结线虫的鉴定
（2）在解剖镜下，用自制的睫毛针将根结线虫二龄幼虫挑至含5μl灭菌水的载破片中，用挑针将根结线虫二龄幼虫截成2-3节，内含物溢出，用枪吸取，置于200μl的PCR管中，加灭菌水补足至8μl，再加入2μl的5×裂解Buffer（10×PCR Buffer与1000μg/ml的蛋白酶K，按1:1的体积比混合）；
（4）将冷冻后的PCR管放置到PCR仪中，65℃1h，95℃10min；
（6）参考Tigano SCAR引物[45]（MK7-F：5'-GATCAGAGGCGGGCGCATTGCGA-3',
（7）取5ulPCR产物于浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上检测所扩增片段的大小，在凝胶成像系统照相和保存。
将鉴定为M. enterolobii的二龄幼虫接种到预先培养在消毒土壤、长有4-5片真叶的番茄幼嫩根尖部，在大棚中培养约42-56d，视墒情适当浇水，注意保持土壤湿度，浇水时防止线虫被水冲淋到土壤下层，每隔20-30d施复合肥一次。