壮骨止痛方对骨质疏松大鼠血清BGP、TRAP、SOD含量的影响

 　摘要：目的 探讨壮骨止痛方对骨质疏松大鼠血清骨钙素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）以及血清超氧化物歧化酶（SOD）表达的影响。 方法 将实验动物分为假手术组、模型组、壮骨止痛方高剂量治疗组、壮骨止痛方低剂量治疗组、雌二醇组5组，用酶联免疫免法测定大鼠血清中BGP、TRAP 、SOD的水平。结果 模型组大鼠血清OPg，SOD降低、TRAP水平升高，经壮骨止痛方药物干预后，大鼠血清OPg，SOD水平明显下降、TRAP水平明显下降。结论 壮骨止痛方药物可以提升大鼠血清OPg，SOD的比值，降低TRAP的水平，达到预防治疗骨质疏松的作用。 
　　关键词：壮骨止痛方;骨钙素;抗酒石酸酸性磷酸酶;超氧化物歧化酶 
　　中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）09-0071-03 
　　骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄等骨的微观结构退化为特征的一种全身性骨病[1]。随着人口老龄化的迅速到来，骨质疏松症已成为严重的社会问题，其发病率已经跃居世界各种常见病的第7位[2]。壮骨止痛方是湖南省名中医莫新民教授研发而成，已经获得国家新药证书（国药证字Z20050125），对绝经后骨质疏松症有良好疗效[3-6]。本研究以经典的骨质疏松动物模型，用壮骨止痛方药物进行干预治疗，检测大鼠血清中BGP，TRAP，SOD 含量变化，从而揭示壮骨止痛方预防治疗骨质疏松的作用机制。 
　　1 材料 
　　1.1 实验药物 壮骨止痛方（补骨脂、淫羊藿、枸杞、党参、白术、芍药、骨碎补、丹参、甘草）药物由陕西中医药大学附属医院药剂科提供，动物灌胃前制备成混悬液，戊酸雌二醇（生产企业：拜耳医药保健有限公司广州分公司，药品批准文号：国药准字J20130009） 
　　1.2 实验动物 SD大鼠50只，SPF级，体重（ 200 ±20）g，雌鼠，购自第四军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK-（军）2012-0007。动物饲养于清洁级饲养室，期间自由饮水、摄食，室温20-25℃，湿度40%-70%，光照周期12h/12h，通风良好。 
　　1.3 试剂与仪器 青霉素（华北制药股份有限公司，国药准字H13020655）;大鼠骨钙素（BGP）ELISA检测试剂盒，大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）ELISA检测试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA检测试剂盒均购自（E20160801A，苏州尔卡文生物科技有限公司）。ELX808-IU酶标仪（美国宝特）;BT-25S型电子天平（上海），0.5-10 l、2-20 l、1-200 l，200-1000 l移液枪。 
　　2 方法 
　　2.1 动物造模 参照文献方法复制雌性大鼠去卵巢3个月的绝经后骨质疏松症模型[7]，取同批次250 g左右的雌性SD大白鼠共40只，月龄10～12个月。按体重将大鼠随机分为假手术组、模型组、壮骨止痛方高剂量治疗组（13.2 g/kg/d）、壮骨止痛方低剂量治疗组（3.3 g/kg/d）、雌二醇组（0.167 mg/kg/d）共5组，每组10只。除假手术组外，其余4组均切除双侧卵巢造成绝经后骨质疏松症病理模型。 
　　2.2 给药方法 假手术组和模型组每天灌胃以相应体积冷开水，壮骨止痛方治疗组、雌二醇组灌胃以相应药物，剂量按成人剂量及人鼠体表面积折算确定。各组均从第5天拆线后开始给药，每天灌胃一次，连续12周。 
　　2.2 标本采集 给�12周，最后一次灌胃后2 h，处死各组大鼠，从腹主动脉取血，分离血清后，再转放入-80℃冰箱中保存备用待分析。 
　　2.3 指标检测 指标检测前，严格按试剂盒说明书进行相关项目的测定。主要测定大鼠血清BGP，TRAP，SOD 含量变化，方法为酶联免疫分析。 
　　2.4 统计学方法 用SPSS16.0软件包分析，实验设计为多因素非平衡的组合类型，将组别拆分成两个组合进行比较，即模型组与空白组进行比较，模型组与观察组、对照组进行比较，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，先进行正态分析，符合要求后各组间差异分别采用单因素方差分析和t检验，P值小于0.05认为有统计学意义。 
　　3 结果 
　　结果如表1所示：（1）与假手术组比较，模型组大鼠血清中BGP含量明显下降（P<0.01），说明绝经后骨质疏松症大鼠造模成功;与模型组比较，壮骨止痛方高剂量给药组和雌二醇阳性药组大鼠血清中BGP含量明显升高（P<0.05），均有统计学差异。提示壮骨止痛方药物对升高绝经后骨质疏松症大鼠血清BGP含量有较好作用。（2）与假手术组比较，模型组大鼠血清中SOD含量明显下降（P<0.01），有显著差异;与模型组比较，壮骨止痛方高剂量给药组、低剂量给药组和雌二醇阳性药组大鼠血清中SOD含量明显升高（P<0.05），提示壮骨止痛方药物对升高绝经后骨质疏松症大鼠血清SOD含量有较好作用。（3）与假手术组比较，模型组大鼠血清中TRAP含量明显升高（P<0.01），有显著差异;与模型组比较，壮骨止痛方高剂量给药组大鼠血清中TRAP含量明显下降（P<0.01），提示壮骨止痛方药物对降低绝经后骨质疏松症大鼠血清TRAP含量有较好作用。 
　　表1 各组大鼠血清中BGP、SOD及TRAP含量变化 
　　注：与假手术组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01 
　　4 讨论 
　　骨质疏松症在中医学多属“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”等范畴，如《素问・痿论》“肾者水藏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”，辨证主要是肝肾亏虚，壮骨止痛方由补骨脂、淫羊藿、枸杞、党参、白术、芍药、骨碎补、丹参、甘草九味药物组成，具有补益肝肾、壮骨止痛之功，防治骨质疏松症，均取得良好疗效。 　　骨钙素（ Osteocalcin，OCN），也称γ-羧基谷氨酸蛋白（ Bone γCarboxyglutamic Acid-Containing Protein，BGP）或 骨 依 赖 维 生 素K 蛋 白（ Bone V itamin K Dependent Protein），BGP 主要由骨和牙齿中的成骨细胞合成并分泌，是体内最丰富的非胶原骨基质蛋白，将其作为羟基磷灰石晶体储存在骨矿物基质中，它被认定为骨形成标志物是反映成骨细胞活性的特异而敏感的标志物[8]，BGP 依种属的不同由 47-50个氨基酸组成，其共同特点是 17、21、24 位有3个羧化的谷氨酸残基以及 23、29 位形成一个分子内二硫健，在 Ca2+存在条件下，羧化后 BGP16- 25 位氨基酸残基形成一紧密的α螺旋结构，这种构象使 3 个谷氨酸残基突向同一方向排列，促进其与羟磷灰石结合[9]。 
　　最新研究表明，骨为新型的内分泌器官，具有内分泌功能[10]，骨钙素为其中之一，其主要的作用途径是：成骨细胞产生的 OCN 以低羧化骨钙素（undercarboxylated-osteocalcin，ucOCN）的形式释放入血，通过血液循环达到多种组织器官调节能量代谢[11]，作用于胰岛β细胞，促进胰岛素的产生和分泌，胰岛素正反馈骨，促进骨钙素的活化，达到预防骨质疏松的目的。 
　　在本实验中，与假手术组比较，模型组大鼠血清中BGP含量明显下降（P<0.01），说明绝经后骨质疏松症大鼠造模成功;经过壮骨止痛方药物干预后，与模型组比较，尤其是壮骨止痛方高剂量组大鼠血清中BGP含量明显升高，（P<0.05），统计学差异明显。提示壮骨止痛方药物可以提升绝经后骨质疏松症大鼠血清BGP含量，增加大鼠成骨细胞的活性，从而达到治疗骨质疏松的作用。 
　　抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）是酸性磷酸酶6种同工酶中的一种，即第 5 型，主要由破骨细胞释放，骨吸收时TRAP 参与骨基质中固体钙磷矿化物的降解，现代医学对于骨质疏松的治疗原则[12]，主要为抑制骨吸收，促进骨形成。因此，血清中的 TRAP可以反映体内破骨细胞活性和骨吸收状态。TRAP 缺乏和过度表达的大鼠模型分别表现为骨硬化和骨质疏松。 
　　在本实验中，与假手术组比较，模型组大鼠血清中TRAP含量明显升高（P<0.01），说明骨质疏松症可以引起TRAP含量下降，经过壮骨止痛方药物干预后，与模型组比较，壮骨止痛方高剂量给药组大鼠血清中TRAP含量明显下降（P<0.01），提示壮骨止痛方可以降低绝经后骨质疏松症大鼠血清TRAP含量，抑制破骨细胞的生成，从而达到治疗骨质疏松的作用。 
　　氧化应激是骨质疏松发病机制研究中的热点，其核心理论是：在衰老或者长期大剂量应用糖皮质激素等刺激物时，机体中活性氧自由基（ROS），ROS在人体处于平衡状态下的自由基浓度很低，不但不会对机体造成损伤，而且还具有信号调节、代谢、生存和凋亡等重要的生理功能，只有在在代谢过程中大量堆积，远远超出机体自身的清除能力，引发氧化应激（OS），并诱导细胞产生衰老和凋亡，最后导致机体发生与骨质疏松等退行性疾病[13]，机体抗氧化酶防御系统中的SOD，能有效地清除过多的ROS，以保持细胞内环境稳定，从而保护机体免受氧化损伤[14]。 
　　在本实验中，与假手术组比较，模型组大鼠血清中SOD含量明显下降（P<0.01）;经过壮骨止痛方药物干预后，与模型组比较，壮骨止痛方高剂量给药组、低剂量给药组和雌二醇阳性药组大鼠血清中SOD含量明显升高（P<0.05），提示壮骨止痛方药物可以提高绝经后骨质疏松症大鼠血清SOD含量，可能通过体内清除引发氧化应激的物质，从而达到防治骨质疏松的疗效。 
　　参考文献： 
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　　（收稿日期：2018-05-15）