医药学论文：论β细胞素对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响

摘要： 目的: 探讨大鼠β细胞素在胰腺干细胞的增殖和转分化为胰岛细胞中的生物学作用。方法: 分离并培养大鼠胰腺干细胞于CMRL1066和无血清DMEM/F12培养液中, 不同浓度大鼠β细胞素处理后, 双硫腙染色, 放免法检测胰岛素分泌量。结果: 在大鼠β细胞素浓度为20～30 mg/L时, 大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的数量明显高于对照组; 其胰岛素分泌量明显高于对照组(P< 0.01)。结论: 大鼠β细胞素具有促进胰腺干细胞转分化为胰岛β细胞并增强其胰岛素分泌的作用。

关键词： β细胞素; 糖尿病 胰腺干细胞

胞生长因子家族中的一个成员, 具有多种生物学功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表达, 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2, 3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法, 将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养, 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛, 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。
1.1 材料
于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。
1.2.1 大鼠胰腺干细胞的分离、 培养
心法纯化消化后的胰腺细胞, 去除胰岛细胞后, 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰岛素+5 mg/L转铁蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L烟碱, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。
分别取培养3、 7、 14 d后的细胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS缓冲液冲洗玻片, 分别与兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗体4℃反应过夜, 二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色, 显微镜观察, 自来水冲洗, 苏木精复染, 中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。
双硫腙(DTZ)为螯合剂, 可与铅、 铜、 锌等螯合, 人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌, 双硫腙染色呈猩红色, 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法: 用二甲基亚砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀释, 0.22 μm滤膜过滤, DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合, 室温5～10 min后做镜检。按胰岛的直径>50 μm计数染色的胰岛样细胞团, < 50 μm者不计。
胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆, 培养于24孔培养板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1 h后, 更换为含高糖（16.7 mmol/L）加烟碱（10 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2 h后, 取培养液上清, 采用放免法测定胰岛素含量。
按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞, 并将其设为正常对照组, 各实验组中分别加入不同浓度的大鼠β细胞素, 依次为10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共设立5个实验组。
采用Student t检验方法, 应用SPSS10.0统计软件完成统计学分析。
2.1 成人胰腺导管上皮细胞光镜下形态学变化