医药学论文：谈小分子肽制备抗体方法的研究进展

摘要：许多生理调节所必须的因子都是很小的肽类, 生物技术的发展也促进了大量小分子基因工程肽类药物的出现, 因而小分子肽的分离、 纯化与鉴定技术日趋重要。小分子肽的界限划分迄今未有明确定义, 一般认为小分子肽的相对分子质量(Mr)均在3000以下。在小分子肽的生物学功能、 鉴定与其相互作用的蛋白质的研究中, 特异性抗体是一重要的研究工具。鉴于小分子肽仅有反应原性, 免疫原性较弱,因此在小分子肽制备抗血清过程中采取多种方法。

关键词： 小分子肽 抗体制备 佐剂 偶联

2 将小分子肽进行融合表达
在基因工程迅速发展的基础上, 有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起, 进而表达所需蛋白, 这种通过在人工条件下融合不同的基因编码区获得的蛋白质称为融合蛋白(FP)。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术, 可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短, 费用低, 是科研中的主要工具。其缺点是原核蛋白表达没有得到确切修饰, 大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物, 需要复杂的变性和复性过程, 大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多, 甚至可被改造成人源型, 真核细胞易被转染, 具有遗传稳定性和可重复性, 产物可被分泌, 提纯简单, 成本低。
首先进行小分子肽基因的克隆:根据基因序列互补原则, 设计合适的引物序列, 以cDNA为模板, 利用PCR技术扩增出不同的目的的DNA片段。然后在载体中进行重组:通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收, 然后通过连接酶将两个具有相同的末端酶切位点的基因片段进行体外连接, 并克隆到高表达质粒载体中, 构建重组质粒。接着将重组表达载体转化/染宿主细胞并利用选择标记进行筛选及测序。最后是融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。原核表达载体pGEX4T1是小分子肽进行融合表达最常用的载体。其启动子上游有一个GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签, 其Mr为26000, 将编码小分子肽基因亚克隆到该载体上, 进行融合表达, 可以增加其相对分子质量。这样, 以融合蛋白的方式制备小分子肽的抗血清既有抗GST, 也有抗小分子肽的抗血清。其他常用的原核融合表达载体还有pET等。Wang等基于蓖麻毒蛋白A链的晶体结构, 把CDR3环上表达抗蓖麻毒蛋白A链抗体（命名为rVHPT）的cDNA（全长360 bp）亚克隆到原核表达载体pET32a（+）上, 经过IPTG诱导表达, 用HisTrap（Co2+）成功地纯化出了抗蓖麻毒蛋白的抗体。Philippa等将编码蛙皮素（magainin, 23个氨基酸左右）的cDNA的片段亚克隆到PET32a载体上与thioredoxin（ 硫氧还蛋白）一起进行融合表达, 然后将融合蛋白免疫兔子, 成功地制备了蛙皮素（magainin）的抗体。Natalia等将编码骆驼IgG2亚型b和c的铰链区片段2bH和2cH分别亚克隆到原核表达载体pGEX5X2上与GST（谷胱甘肽巯基转移酶）进行融合表达, 成功地制备了2bH和2cH的抗血清。Yang等将mRabL5的cDNA序列（全长558 bp）亚克隆到融合表达载体pGEX4T1上, 经过IPTG诱导表达, 将融合蛋白GSTmRabL注射兔子, 成功地制备了兔抗mRabL5抗血清。此外, 通过融合蛋白基因表达的方式获得包括若干功能域和报告域的融合蛋白, 通过这种方式可以制备同时具有免疫学特性功能域和酶催化特性报告域(如碱性磷酸酶、 荧光素酶、 绿色荧光蛋白等)的融合蛋白, 并利用其功能域对小分子肽的亲和性和报告域的酶促级联放大作用进行免疫学检测, 较之传统使用酶联第二抗体的方法节约了检测时间和检测成本。