医药学论文：浅析氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、 鉴定及应用

1 材料和方法
免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂购自Sigma公司; 羊抗鼠IgGHRP购自中山公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱购自Amersham公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜购自Amersham公司; ECL反应试剂盒购自Amersham公司; 半干转印仪购自BioRad公司; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备
1.2.2 鼠抗人mAb的制备
。
(1)抗原的质谱鉴定: 应用mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原, 并进行SDSPAGE电泳, 根据Western blot结果显示的阳
1.2.4 mAb的鉴定
2 000稀释的mAb, 室温下孵育2 h, TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。(2)免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST浸洗3 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 μL, 室温孵育15 min, 滴加H2O2甲醇, 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭20 min, 加入1∶100稀释的鼠抗人CPS1 mAb, 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。(3)免疫荧光染色: 取liver carcinoma cells (HCV)细胞, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液, 将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中, 置50 mL/L CO2, 37℃孵箱中培养1～3 d, 待细胞接近长成单层, 加入适当稀释的罗丹明123, 置50 mL/L CO2, 37℃孵箱中培养30 min, 取出盖玻片, 浸入PBS（0.01 mol/L, pH7.4）,