医药学论文：谈早孕期绒毛短期培养后染色体制备方法的改进

摘要：目的 在以往研究的基础上，改进早孕期绒毛短期培养后染色体制备的方法。方法 采用的培养液血清浓度为5%，绒毛细胞经过48 h培养，将酶解离细胞、低渗处理与高浓度秋水仙素处理简化为一步，使用冰醋酸分步解离。结果 染色体分散好，带型清晰。结论 该技术简单省时，易于操作，成功率较高，便于临床推广使用。

关键词： 绒毛;染色体

1 资料和方法
1.2 方法 ①无菌条件下,将取出的绒毛组织立即放入RPMI 1640+抗生素的培养液中漂洗,在倒置显微镜下去除蜕膜组织及血污后,投入装有5 ml培养液(RPMI 1640+胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺+抗生素)的培养瓶中,37℃恒温箱培养48 h。胎牛血清有0、5%、10%、20%4个浓度。②将绒毛转入含下列成分(2.0 μg/ml秋水仙素+1∶1的0.4%枸橼酸钠-0.4%KCl+EDTA-胰蛋白酶液)的溶液中，37℃处理40 min，每隔10 min悬浮1次。③加入新配制甲醇冰醋酸(3∶1)固定液1 ml预固定2 min，轻轻混匀。④离心(1 000 r/min)10 min，弃去上清液，加入固定液5 ml，吹打混匀后置于室温下固定35 min。⑤吸去固定液，加入新配制的40%冰醋酸溶液0.2 ml混匀解离1 min，随后加入0.8 ml 60%冰醋酸混匀继续解离3 min，待绒毛周围出现浑浊。⑥加入甲醇3 ml混匀，轻轻吹打数分钟，挑出绒毛枝后离心。⑦弃去上清液，加入固定液0.5 ml滴冰片，置80℃烤箱2 h。⑧0.005%胰蛋白酶液处理6～8 min，Giemsa染色。
不加血清组分裂相数目最多，但染色体形态不如加5%血清者，而血清浓度大于5%时，分裂相数目却有降低趋势，血清浓度为5%的时候染色体形态最佳。50例绒毛标本中46例获得分裂相，每片20～40个分裂相不等。染色体分散好，带型清晰(图1)。10例人工流产标本染色体核型：6例46，XX;4例46，XY。40例胚胎停育标本中4例未获得分裂相，在36例获得分裂相的标本中4例46，XX;6例46，XY;其余26例均是异常核型:6例69,XXX; 8例47,XX,+21;6例47,XX,+16;3例47,XX,+17;2例47,XX,+3;1例48,XY,+15，+22。 图1 用改进的绒毛短期培养法制备的染色体核型图
自然流产及胚胎停育绒毛组织由于受污染和标本不新鲜等原因的影响，难以分析染色体结果。我们认为挑选质地较好的绒毛很关键，一般选新鲜、短胖、粗壮型为佳。我们在绒毛染色体制备的直接法和培养法[3-4]基础上进行了一些有益的探索。在传统的绒毛培养过程中，培养液中血清的浓度变化很大，一般为5%～20%，还有的不加血清。我们的实验发现血清浓度为5%的时候染色体形态最佳，和文献报道一致。细胞周期重新开始的理想恢复时间为48 h，本实验组所有绒毛细胞均经过48 h培养。我们研究发现将秋水仙素浓度提高到2.0 μg/ml，既能缩短培养时间，又能获得长短适中、形态良好的染色体核型。在国内外资料中，传统方法一般以60%冰醋酸一步解离，但染色体容易发毛。本组实验先以40%冰醋酸少量短时作用(1 min)，再加入60%冰醋酸进一步解离，从而减少对染色体的损伤，防止染色体发毛。我们还将培养后的绒毛直接放入含2.0 μg/ml秋水仙素+1∶1的0.4%枸橼酸钠-0.4%KCl+EDTA-胰蛋白酶的混合液中，即将传统的解离、秋水仙素处理和低渗处理三个步骤合并为一个步骤，从而简化过程，节省了实验时间。经过上述改良后，可使每张片子的可分析的中期分裂相数目增加2倍，染色体分散好，带型清晰，易于观察，诊断成功率达96%，且改进后的实验方法更简单省时，易于操作，便于临床推广使用。