医药学论文：益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠缺氧诱导因子-1α 和血管内皮细胞生长因子的影响

【摘要】 探讨益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的影响。方法:72只清洁级雄性SD大鼠，除8只作正常对照组外，其他大鼠在背部全层皮肤缺损开放性创面的基础上加造气虚血瘀证糖尿病模型后，随机分为模型组、贝复济组、益气化瘀组、益气组和化瘀组。应用免疫组织化学、图像分析等技术，观察各组大鼠创面肉芽组织中HIF-1α和VEGF水平的变化。结果:模型组HIF-1α水平高于正常对照组（ P < 0.01），VEGF浓度明显低于正常对照组（ P < 0.01）。各用药组HIF-1α表达水平明显低于模型组（ P < 0.01），VEGF表达水平明显高于模型组（ P < 0.01）。益气化瘀组HIF-1α表达水平明显低于贝复济组、益气组和化瘀组（ P < 0.05或 P < 0.01），VEGF表达水平明显高于贝复济组（ P < 0.01）。益气组与化瘀组HIF-1α和VEGF的表达水平相似，它们与贝复济组之间无明显差异。结论:益气化瘀中药能明显促进糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠的创面愈合，其机制与下调HIF-1α水平、上调VEGF的表达水平和改善局部缺血缺氧状态有关。
我们在长期的临床实践中发现，益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡有显著的疗效［1］。为进一步探讨益气化瘀中药促进创面愈合的作用机制，开展了以下研究。
1.1 实验动物 72只雄性SD大鼠，清洁级，2月龄，体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。动物合格证号:医动字第02-22-2号。

1.4 主要实验仪器 IMS细胞图像分析系统和医学图像分析软件，上海申腾信息技术有限公司产品; 摄像机（型号:MV-CP410），Panasonic公司产品;显微镜，Olympus公司产品;BH2数码相机，Nikon公司产品。
1.6 实验动物分组与给药方法 72 只大鼠先随机抽取8只为正常对照组，创面制作方法同前;其余64只大鼠建立糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证模型，造模过程中，未成糖尿病模型的7只，死亡3只。 54只 大鼠成模后再随机分为益气化瘀组（10只）、益气组（11只）、化瘀组（11只）、贝复济组（11只）、模型组（11只）。各组于造模后次日开始给药，换药前均以1/5 000呋喃西林溶液清洁创面。正常对照组及模型组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃， 1次/d; 益气化瘀组、益气组、化瘀组外敷单层生理盐水纱布，中药灌胃，1次/d;贝复济组外敷以贝复济浸透纱布，按创面大小剪成小块贴于创面上，然后均在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布"丰"字形固定，生理盐水灌胃，1次/d。连续用药7 d，停药后次日，分别将动物麻醉（氯胺酮）处死，取局部创面新生肉芽组织为所需实验样品。
1.7.1 免疫组织化学S-P法 取各组大鼠创面新生肉芽组织，生理盐水清洗后，10%甲醛溶液固定。每组随机选取8个样本，将已固定的各肉芽组织标本分别常规脱水，浸蜡，包埋，连续切片。取4 μm石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水。PBS洗涤3次，3 min/次;3% H2O2室温20 min，PBS洗涤3次，3 min/次;将切片浸入0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波Ⅲ档（98 ℃）2次进行抗原修复，10 min/次，取出后在室温下自然冷却;滴加10%正常血清封闭内源性非特异性抗原，室温 30 min; 滴加一抗（分别为上述抗体及相应抗体稀释度），4 ℃冰箱过夜;PBS洗涤3次，3 min/次;滴加生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37 ℃ 30 min;PBS洗涤3次，3 min/次;Streptavidin-HRP 1∶200，37 ℃ 30 min;PBS洗涤3次，3 min/次;0.05% DAB+ 0.03% H 2O2显色8～12 min，流水洗;苏木素衬染，流水洗;吹干，常规树脂封片。检测以胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒者判定为阳性细胞，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。