医药学论文：研究松果菊苷对大鼠脑缺血损伤的保护作用

1 材料与方法
1.2 动物分组及模型制备雄性SD大鼠共50只，体质量250～300 g，购自新疆实验动物研究中心（合格证号：2009-0053）,随机分为5组：①假手术组：生理盐水1 ml·kg-1·d-1×7 d；②模型组：生理盐水1 ml·kg-1·d-1×7 d；③脑缺血+阳性药物对照组：盐酸川芎嗪50 ml·kg-1·d-1×7 d；④脑缺血+ECH大剂量组：ECH 50 mg·kg-1·d-1×7 d；⑤脑缺血+ECH小剂量组：ECH 25 mg·kg-1·d-1×7 d。各组动物每天连续腹腔注射给药7 d，于末次给药1 h后,清醒状态下用10%水合氯醛（3.0～3.5 ml·kg-1）麻醉，采用Longa等［1］提出的改良线栓法法制作大鼠左侧大脑局灶性脑缺血模型(MCAO模型)。假手术组只是鱼线插入仅10 mm，其余步骤同手术组。
1.4 TTC染色动物麻醉，取脑-20℃冰箱中速冻20 min，冠状位每隔2 mm切片（5片）。切片置于2%TTC液中，避光放入37℃水浴锅中孵育30 min，4%多聚甲醛固定保存。
1.6 细胞凋亡采用TUNEL［4］法，按细胞凋亡原位检测试剂盒说明书标记凋亡细胞。具体步骤如下：脑组织切片常规石蜡脱水，滴加TUNEL反应混合物，37℃孵育60 min，滴加转化剂-POD（辣根过氧化酶标记），室温放置15 min，期间用磷酸缓冲液PBS冲洗样本3次，再滴加100 μl的1，2-二甲基苯胺（DAB）底物溶液，室温孵育5～20 min，镜下出现浅棕色背景时，终止反应，苏木素复染。脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。
2.1 脑片TTC染色缺血后缺血侧鼠脑肿胀，有明显的梗死灶形成，TTC染色显示正常脑组织呈红色，梗死灶脑组织呈苍白色；所有评分在1～3分大鼠的脑片经TTC染色后均有苍白色梗死灶出现（图1），表明模型的制作是成功的。
2.3 细胞凋亡 TUNEL染色光学显微镜下观察（图3）：阳性染色位于细胞胞核，呈棕黄色，正常细胞染色位于胞核，呈蓝色。①假手术组偶见细胞着棕色，细胞结构尚好；②模型组出现最为显著的神经元凋亡，表现为整个细胞皱缩，体积缩小，核固缩；③与假手术组相比，模型组海马区细胞凋亡数量明显增加；④与模型组比较，川芎嗪组、ECH大剂量组和ECH小剂量组海马区凋亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少。
3 讨论