医药学论文：益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠转化生长因子β1的影响

【关键词】 糖尿病; 皮肤溃疡; 转化生长因子β1; 大鼠
1 材料与方法
1.2 药物 益气化瘀方由生黄芪、太子参、桃仁和地龙组成，剂量比例为2.5∶2.5∶1∶1，大鼠的剂量为11.61 g/(kg·d)，减压浓缩至浓度为含生药2.5 g/ml。拆方益气方由生黄芪和太子参组成，大鼠的剂量为6.75 g/(kg·d)，减压浓缩至浓度为含生药1.5 g/ml。拆方化瘀方由桃仁和地龙组成，大鼠的剂量为4.86 g/(kg·d)，减压浓缩至浓度为含生药1 g/ml［2］。均由上海中医药大学龙华医院制剂室按水煎醇沉工艺制备成煎剂浓缩，4 ℃冰箱保存备用。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）贝复济，珠海东大生物制药有限公司产品（批准号：国药准字S10980077）。
1.4 主要实验仪器 RM2145切片机，Leica公司产品；IMS细胞图像分析仪，上海申腾信息技术有限公司产品；MVCP410摄像机，Panasonic公司产品；BH2显微镜，Olympus公司产品；DYY8C电泳仪、DYCZ24D电泳槽和DYCZ40D转印槽，均为北京六一仪器厂产品；721分光光度计，上海分析仪器总厂产品。
1.6 实验动物分组及给药方法 60只大鼠先随机抽取10只为正常对照组；其余50只大鼠建立糖尿病溃疡模型，成模后再随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、贝复济组和模型组。各组于造模后次日开始给药，换药前均以1/5 000呋喃西林溶液清洁创面。正常对照组及模型组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃，1次/d；益气化瘀组、益气组和化瘀组外敷单层生理盐水纱布，中药灌胃，1次/d；贝复济组灌服等量生理盐水，外敷以贝复济浸透纱布（60 U/cm2），按创面大小剪成小块贴于创面上，然后均在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布"丰"字形固定。连续用药7 d，用药后第8天，分别将动物麻醉（盐酸氯胺酮），取局部创面新生肉芽组织为所需实验样品。
1.7.1 免疫组织化学SP法及图像分析 每组随机抽取8个标本作为实验样本，取4 μm石蜡切片，常规脱蜡，PBS冲洗3次，3 min/次；3％ H2O2室温20 min，PBS冲洗3次，3 min/次；柠檬酸盐缓冲液中微波处理（98 ℃）2次，10 min/次；10%正常血清封闭内源性非特异性抗原，室温30 min，一抗4 ℃过夜，PBS冲洗3次，3 min/次；生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37 ℃ 30 min，PBS冲洗3次，3 min/次；StreptavidinHRP 1∶200，37 ℃ 30 min，PBS冲洗3次，3 min/次；DAB显色8～12 min，水洗；苏木素衬染，水洗，吹干，树脂封片。显微镜下观察，有棕黄染色者为阳性。采用IMS细胞图像分析系统，对各组免疫组化切片进行图像分析。根据各组切片中的染色条件，在统一阈值下进行。在10倍物镜下，每张切片随机选取3个视野，输入图像，测定各组在统一光度下阳性细胞的总面积。
1.8 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，以方差分析比较各组间TGFβ1表达水平的差异。
2.1 免疫组织化学法检测各组创面肉芽组织中TGFβ1的表达水平 模型组TGFβ1表达明显低于正常对照组（P＜0.01）；益气化瘀组TGFβ1表达量高于益气组、化瘀组、贝复济组和模型组（P＜0.05或P＜0.01），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；益气组和化瘀组的TGFβ1表达量也明显高于模型组（P＜0.01），与贝复济组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；益气组和化瘀组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。