医药学论文：探讨鱼腥草蛋白酶抑制剂的分离和纯化

摘要：目的以鱼腥草为材料，研究鱼腥草蛋白酶抑制剂(HCTI)的分离提取工艺。方法HCTI的最佳粗提条件是采用pH 7.0的双蒸水为提取溶剂，在体积比为1∶30， 45 ℃条件下浸提2.0 h，提取2次。硫酸铵部分沉淀后，再经DEAE-52离子交换层析柱纯化。结果粗提液经45％～60％饱和度的硫酸铵沉淀比活力最高，经过DEAE-52离子交换层析柱梯度洗脱后，检测到HCTI活性峰。结论用DEAE-52离子交换层析柱可分离纯化HCTI，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，计算出该HCTI的分子量约为28 KDa。

关键词： 胰蛋白酶抑制剂； 鱼腥草； 分离纯化

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本文在前期研究的基础上，对鱼腥草中TI进行了分离纯化，获得的结果对开发植物来源的TI具有重要意义。
1.1 试剂胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司) ，苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司)，DEAE-纤维素(Sigma)，三-羟甲基-氨基甲烷，无水氯化钙，盐酸，三氯乙酸，氢氧化钠等为国产分析纯。
2 方法
2.2 鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化参考康庄等［4］的方法进行。
3.1 硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵沉淀表，对样品浸提液添加硫酸铵至30％，45％，60％，75％饱和浓度，分别测定各浓度下的体积、抑制活性和蛋白浓度。pH值为6.0的样品浸提液实验结果见表1，pH值为8.0的样品浸提液实验结果见表2。表1 pH 6.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）表2 pH 8.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）
从图1可以看出，两种不同pH体系活性析出均集中于30％～75％饱和度，但45％～60％饱和度下比活力最高，且pH 8.0体系时比活力大。因此，在以后的纯化过程中，均采用pH 8.0溶液体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀，加(NH4)2SO4至40％饱和度，以除去碱性或中性杂蛋白。再加(NH4)2SO4至60％饱和度，收集沉淀，溶解透析供下步离子交换层析用。抑制剂的析出在pH 6.0体系比pH 8.0体系要早，这说明抑制剂可能是一种酸性蛋白。
由图3可知, 在55～70号试管具有HCTI活性，以60～63号活性最高。收集60号试管及附近活性较高的试管保存，进一步处理后进行HCTI相对分子量的测定。洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系见表3。表3 洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系（略）
DEAE-52离子交换柱分离纯化后HCTI液的活性峰经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图4。
4 讨论
本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白，分离过程中用到了DEAE-52离子交换层析法，并检测到活性峰。说明分级盐析发挥了一定作用，从而简化了分离纯化过程，测得HCTI分子量约为28 kDa。为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研究奠定了一定的理论基础。