医药学论文：CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望

CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：

(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；

(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；

(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；

(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：

②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；

③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；

④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
（1）优点
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。

2．毕赤酵母细胞表达系统
自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势：
2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；
4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；
6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
尽管甲醇营养型酵母表达系统被认为是极具发展前景的真核表达系统，许多表达产物已用于临床治疗及预防，但它并不是万能的表达系统，作为一种新的表达系统，和其它表达系统一样，巴氏系统也并非尽如人意，同样有其局限性，仍然存在这样或那样的缺陷或不足。如分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在，发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达；利用易燃的甲醇做原料，表达产物的卫生安全性需要考虑；筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限；低表达或不表达的例子也在增多。信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难。而且，与安全可靠、背景清楚的酿酒酵母相比，巴氏系统还有其它缺点：
(2)不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇， 所以，要用它来生产药品或食品还没有被广泛接受。
其中最重要的一个缺陷就是分泌表达的蛋白在培养基中被自身分泌的蛋白酶降解，由于甲醇酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高。
其次，有些蛋白在毕赤酵母中表达量很低或不表达，原因至今尚未完全阐明，但可能与以下几方面有关：
②当整合拷贝数增多后，可能在转录水平产生后生(Epigenetic)的调节，影响重组蛋白产率的提高；
诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。