医药学论文：神经干细胞移植及其在缺血性脑卒中治疗中的应用

【摘要】 神经干细胞（neural stem cells，NSCs）作为具有自我更新及分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞潜能的神经前体细胞，具有广泛的临床应用前景。通过移植可以从结构及功能上修复、改善神经系统疾病。本文就神经干细胞生物学特性，移植治疗的研究现状及在缺血性脑卒中治疗中的应用做出综述。
【关键词】 神经干细胞；移植；缺血性脑卒中
【Abstract】 Neural stem cells(NSCs) are the selfrenewing，multipotent cells that generate neurons，astrocytes，and oligodendrocytes in the nervous system and have a extentive perspective in clinic.Through transplantation can amelioration nervous system disease in tissue and function.In this paper，the biological charater，the transplantation current situation and the application in infarction of the neural stem cells were reviewed.
【Key words】 neural stem cells；transplantation；ischemic cerelral infarction
目前，神经系统难治性疾病，包括变性疾病、脑卒中后遗症等多为大量神经元缺失，神经系统无法产生新的神经元，建立新的突触联系，致使中枢神经系统损伤后结构和功能难以恢复。20世纪90年代以来，神经干细胞相继从哺乳动物及人的中枢神经系统分离培养成功后，"中枢神经系统损伤后不可再生"的传统观念被打破，随着对神经干细胞研究的深入，神经干细胞能够分化成为神经元并促进脑组织结构和功能的恢复，通过神经干细胞移植，有望治疗一些迄今尚无有效治疗方法的中枢神经系统疾病。
1 神经干细胞概述
1.1 神经干细胞的概念 研究证实，干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。1992年Reynolds等从成年小鼠纹状体分离出能在体外不断分裂增殖，并具有多向分化潜能的细胞，首次提出了神经干细胞的概念［1］。Mckay于1997年在Science杂志上将神经干细胞的概念总结为具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力、能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞［2］。Gage将神经干细胞的特性概括为：（1）可生成神经组织。（2）具有自我更新能力。（3）可通过不对称分裂分化产生新的细胞［3］。
1.2 与移植相关的生物学特性 神经干细胞除具有自我更新能力，多向分化潜能等干细胞基本属性外，尚具有有利于移植的一些特殊属性。（1）对称分裂和不对称分裂。神经干细胞对称分裂产生的两个子代细胞可以均为干细胞，也可以是一个干细胞，一个祖细胞或两个均为祖细胞；不对称分裂则产生一个干细胞和一个祖细胞，这样既能维持干细胞的自我更新又能不断产生祖细胞以补充分化的祖细胞，保持干细胞池的相对稳定［4］。（2）迁移能力。神经干细胞在体内的迁移受多种因素调控，包括细胞的成熟度、微环境机制状态、细胞间的相互作用。干细胞自身及周围细胞分泌的细胞因子、递质、激素、代谢产物等的影响，在神经干细胞移植治疗神经系统疾病时，可以将其移植到病变边缘，使神经干细胞在病变区表达信号的引导下向病变区移动，参与神经结构与功能的修复［5］。（3）低免疫原性。神经干细胞是原始细胞，具有低免疫原性，不表达MHC-1、MHC-2等成熟细胞抗原。Mode报道，将MHP36细胞移植MCAo（大脑中动脉梗死）小鼠模型后，未见明显急性免疫排斥反应，干细胞在宿主体内未表达MHC-1和MHC-2，CD45及CD146，表明神经干细胞可能缺乏免疫原性，有利于神经干细胞的成功移植［6］。（4）良好的组织融合性。Englund报道，将外源性神经干细胞移植到新生小鼠皮质和海马区，4周后，观察到这些外源性神经干细胞分化生成的细胞不仅具有神经元的典型形态和特异性表面标志，而且生发出长的轴突，分别参与形成了皮质丘脑束和双侧海马交叉连接，还与周围神经元形成了广泛的兴奋性、抑制性传入传出连接，并能产生动作电位［7］。神经干细胞与宿主神经组织的良好融合，确保了移植神经干细胞的长期存活，并达到结构与功能修复的作用。
2 神经干细胞移植的研究现状
2.1 神经干细胞供体来源 过去20年里，寻找适合的神经干细胞供体来源的实验研究一直没有停止过。由于免疫、取材及伦理学问题，目前研究较多的神经干细胞供体包括永生性神经干细胞系、异种神经干细胞等。
2.1.1 永生性神经干细胞系 经典的永生性方法是用携带癌基因的逆转录病毒转导发育中的神经细胞，使得细胞停留于细胞分化的某一时期，不能进行终末分化，并获得了长期传代的能力。常用基因是myc、neu、p53、腺病毒EIA和SV40大T抗原热敏突变体。MHP36细胞是tsA58癌基因的永生性神经干细胞系，移植入受体后在37℃时分化为神经元和胶质细胞［8］。Veizovic研究报道，在小鼠局部脑出血模型，对侧纹状体注射MHP36细胞，可以观察到移植细胞向缺血区迁移，大约有1/3的供体细胞经纹状体向缺血半球迁移［9］。Snyder等从新生小鼠神经外胚层细胞建立C17.2永生性神经干细胞株，将C17.2细胞注射到新生小鼠脑室区，1周后注射对侧大脑半球接受缺血损伤，亦报道移植细胞向缺血区域迁移［10］。永生性神经干细胞系具有容易贮备、管理、可商品化培养的特点，成为当前的研究热点。
2.1.2 异种神经干细胞 异种神经干细胞移植是治疗神经系统疾病潜在的供体来源，尽管尚有免疫学争议存在，已经有实验研究证实异种神经干细胞移植为一种有效的治疗手段。Savitz报道，将猪胚胎神经干细胞移植入鼠缺血动物模型纹状体及皮层，12周后，移植物存活率超过80%，并且供体细胞分化为神经细胞［11］。
2.2 神经干细胞移植的常用方法 包括（1）细胞悬浮液立体定位注射法；（2）胶原基质包埋法；（3）（生物材料）吸附移植法；（4）静脉内细胞悬液输入法；（5）脑室内细胞悬液注射法。可根据病变类型及实验需要选择，移植后做活体指标监测，观察治疗效果。
2.3 神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究 神经干细胞作为移植细胞或载体，具有许多移植治疗的优点：（1）能建立不同的干细胞株品系；（2）可以分化成神经元和胶质细胞，结构上易与宿主固有组织整合而无免疫反应；（3）能在脑内做远距离扩散，无肿瘤形成；（4）对宿主CNS无任何损害也不干扰其正常的脑功能；（5）基因表达稳定，维持时间较长；（6）具有可调控性；（7）在中枢神经系统中，它不受血脑屏障限制，能以稳定直接的方式运送基因产物或替换无功能神经细胞。神经干细胞治疗中枢神经系统疾病目前仍处于实验研究阶段，包括变性疾病、损伤、肿瘤、代谢疾病等领域，目前研究较多的是变性疾病，如帕金森病（Parkinson's disease，PD)、亨廷顿病（Huntington's disease，HD)、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD)、脱髓鞘疾病等。
2.3.1 帕金森病 帕金森病为中脑-黑质纹状体内的多巴胺神经元变性，导致多巴胺递质分泌减少，常规药物及手术治疗只能缓解病情，不能从根本上治疗病因。神经干细胞移植治疗帕金森病已取得良好效果，植入的神经干细胞可以在帕金森大鼠脑中长期存活，移植2周时可见大量未分化细胞，一些细胞从移植部位迁移，整合进入宿主的纹状体中。20周时移植的细胞明显减少，但分化形成的酷氨酸羟化酶阳性的细胞存活良好，并可检测到分化形成的星形胶质细胞。同时，神经干细胞的移植可以改善帕金森动物的行为学障碍［12］。虽然有越来越多的文献报道神经干细胞移植到纹状体和黑质等部位向多巴胺神经元分化，但是由于各报道所采用的组织来源的种属和部位、体外分离培养方式和时间以及移植对象等因素的不同，对帕金森病模型神经通路的功能修复和行为学改善等方面结论各异。将来源于中脑和纹状体的神经干细胞移植到PD模型大鼠的纹状体中，发现前者可以很好地分化出酪氨酸羟化酶阳性的神经元，而后者则不能，说明干细胞的来源可能对其最终表型有一定的影响［13］。日本一研究小组制备了nestin调控序列下游表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP)的转基因大鼠，大鼠胚胎中脑细胞同时表达GFP和CD133表面标志，利用流式细胞术分离出表达GFP的细胞具有神经干细胞的增殖和分化特性，移植到帕金森病大鼠纹状体可以重建多巴胺的功能，改善大鼠的行为学障碍［14］。这一研究成果为下一步利用多巴胺神经元移植治疗帕金森病打下了基础。
2.3.2 阿尔茨海默病 阿尔茨海默病是因为海马和新皮层胆碱乙酰转移酶及乙酰胆碱显著减少，皮层胆碱能神经元递质功能紊乱，导致记忆和认知功能障碍的一种疾病。Gray等用兴奋毒素注入前脑的胆碱能功能区，破坏该区制成AD动物模型，然后用MHP36细胞悬液注入损伤区域。形态学观察，见有神经元和胶质细胞表型且认知功能恢复，说明MHP36细胞能分化成胆碱能神经元［15］。Wang Qinghua等将胚胎干细胞来源的胆碱能神经干细胞移植入大鼠阿尔茨海默模型，发现移植物存活并主要分化为胆碱能神经元，8周后迷津试验显示干细胞移植组记忆功能恢复到正常水平［16］。Zhao等分别将单纯神经干细胞和经人脑源性神经营养因子修饰的神经干细胞移植入大鼠阿尔茨海默模型，2周后，莫里斯水迷宫试验显示移植组大鼠行为障碍明显改善，且经人脑源性神经营养因子修饰的神经干细胞移植组优于单纯神经干细胞移植组［17］。为阿尔茨海默病的治疗提供了新的途径。
2.3.3 脱髓鞘疾病 脱髓鞘疾病是因各种因素致轴突脱髓鞘引起神经功能障碍的疾病。形成正常髓鞘的细胞在中枢神经系统为少突胶质细胞，周围神经系统为雪旺细胞和嗅神经的鞘细胞。Akiyama等将人成年脑组织来源的神经前体细胞移植入脱髓鞘的小鼠模型脊髓内，发现神经干细胞可分化为少突胶质细胞和雪旺细胞，轴突髓鞘再生，神经冲动的传导也基本恢复到正常水平［18］。Oka等报道将来源于猴室管膜下区的自体神经干细胞移植到经X线照射并椎管内注射溴化乙锭制作成的脊髓脱髓鞘模型，3周后观察移植组脱髓鞘区髓鞘再生，对照组则无髓鞘形成［19］，这一结果为人类治疗脱髓鞘疾病提供了一个新的方法。
2.3.4 肿瘤 神经干细胞在治疗CNS肿瘤方面也有着诱人的前景。CNS肿瘤的治疗不仅要求肿瘤本身的去除，而且更为重要的是因肿瘤生长而造成的损伤组织的修复和功能的恢复。Benedetti等将转染了IL-4的基因修饰神经干细胞移植到注射了CL261鼠胶质瘤细胞系的CNS肿瘤模型的鼠脑中，此神经干细胞可以分泌IL-4，能够促进肿瘤患鼠的恢复，移植的细胞在脑内可以长期存活［20］。Yang等报道，将转染了IL-12的基因修饰人神经干细胞移植到恶性胶质瘤模型的鼠脑中，可发现经修饰的神经干细胞与肿瘤细胞交织，并有大量CD4（+）和CD8（+）T淋巴细胞浸润，证实了转染了IL-12的基因修饰人神经干细胞具有很强的抗肿瘤作用［21］。Tang等证实神经干细胞能向肿瘤细胞的方向迁移，并有限聚集于肿瘤区域［22］。
2.3.5 神经干细胞的其他应用 神经干细胞作为稳定的细胞群体，可以成为外源基因的良好载体进行基因治疗［23］。
3 神经干细胞移植在治疗缺血性脑卒中的应用
脑卒中是神经系统的常见病，是目前人类死亡的三大疾病之一，也是最常见的致残疾病，发病率逐年上升，其中以缺血性脑卒中最为常见。缺血性脑卒中以神经元坏死或凋亡最为突出，也是该病治疗效果欠佳的主要原因。神经干细胞能够促进神经元再生和损伤脑组织的修复，许多学者开始研究神经干细胞治疗缺血性脑卒中，并取得了重大进展。
3.1 NSCs移植的时机选择 当前关于缺血性脑卒中发生后施行神经干细胞移植的时机选择尚存在分歧，移植的时间窗相对较宽，平均时限为2～3周，但是急性期移植物存活率较低，原因可能为：（1）宿主在脑组织缺血区的急性渗出、水肿及变性坏死等过程，使移植物得到的影响减少，并可能释放某些神经毒性物质；（2）在缺血急性期移植物建立血供困难；（3）脑组织缺血后可产生神经营养因子，急性期由于神经营养因子浓度低下，不易移植成功，急性期过后神经营养因子浓度增高，移植物易于成活。Kondziolka在进行的神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中的人体试验中，入选病例为卒中发生6个月～6年［24］。
3.2 NSCs移植的卒中类型选择 由于缺血性脑卒中发生的类型、病变的部位以及范围各不相同，使神经干细胞移植选择病例变得困难。Kondziolka在所进行的实验中所选的为局部缺血损害病例，相对于弥漫性脑缺血损害，可能更容易获得良性分析结果［24］。并且目前尚无研究资料证实，神经干细胞移植治疗对于脑白质损害和皮层损害疗效有何不同。
3.3 移植所取得的进展 当前利用外源性异体神经干细胞移植治疗脑缺血的研究较多，也取得了一些成功的经验。从胚胎和成年脑内分离出NSCs，在体外培养扩增后移植入缺血周围区，利用其分化和迁徙特性，代替脑缺血后坏死的神经细胞，治疗缺血性脑损伤。Toda等将神经干细胞植入缺血的大鼠海马纹状体CA1区，发现1%～3%的移植细胞长期存活，其中3%～9%的细胞分化为神经元，这些存活的神经元改善了大鼠的空间认知功能［25］。Kon Chu报道，将转染了β-半乳糖的人神经干细胞经静脉移植到成年MCAo模型大鼠，以X-半乳糖做细胞组织化学法和β-半乳糖免疫组织化学法标记神经干细胞，分别用迷宫转向试验（turning in an alley，TIA）、改良肢体平衡试验（modified limp placing test，MLPT）和旋转加速试验（rotated)观察大鼠感觉运动功能的恢复，结果表明，实验组2周后TIA测验评分，3周后MLPT和Rotated试验评分明显高于对照组，并且能够在缺血区边缘检测到神经干细胞及神经元、星形胶质细胞特异性表面标志，移植后8周，实验组梗死灶面积明显减小，移植后540天仍能够在实验组大鼠脑内检测到β-半乳糖阳性细胞，证实静脉注射法异体移植神经干细胞能够迁移至缺血区域并能分化产生神经元、星形胶质细胞，并能修复损伤部位组织结构，同时恢复感觉运动功能［26］。Modo等研究发现，移植7天内神经干细胞主要沿着胼胝体向损伤区迁移，14天时在损伤区重新聚集，同时移植到缺血区脑组织内的神经干细胞能调节载脂蛋白E的表达，并认为载脂蛋白E与脑缺血损伤后功能恢复相关［27］。Ishibashi报道，从人端脑组织分离培养神经干细胞，体外扩增后，移植到脑局部缺血4天的蒙古沙鼠模型，4周后观察，实验组缺血面积明显减小，大约8%移植入的神经干细胞存活，并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，感觉运动功能比对照组明显恢复［28］，表明人神经干细胞经体外扩增后可成为治疗缺血性脑卒中的供体来源。
由于神经干细胞在脑内的迁移和分化需要一定的时间，而目前尚未发现明确的由神经干细胞分泌的促进神经再生的细胞因子，单纯依靠神经干细胞移植治疗脑缺血难以产生良好的效果。将转染神经生长因子的神经干细胞移植到缺血半暗带区，早期利用其分泌的基因产物，防止神经元凋亡；晚期利用其增殖及分化特性，可用于缺血性脑损伤治疗。
Andsberg等报道，携带神经生长因子的神经干细胞移植入大鼠的海马，1周后制作脑缺血模型，其梗死面积和坏死神经元数目明显少于不携带神经生长因子神经干细胞的移植［29］。
4 问题与展望
神经干细胞移植的研究为多种神经系统疾病及缺血性脑卒中的治疗提供了一条新的途径，显示出巨大的潜力，但有很多问题尚待解决：（1）神经干细胞体内外增殖分化机制以及细胞系的建立；（2）移植过程中的急慢性免疫排斥反应；（3）有否具有正常神经细胞的分泌递质，产生动作电位，与周围神经元建立突触连接的能力；（4）伦理问题等。随着研究的深入，科技手段的进步，对于神经干细胞的研究使人们越来越相信，神经干细胞能够为神经系统疾病提供丰富的细胞来源，将成为神经系统疾病治疗的新手段，也可作为神经系统疾病的药物筛选平台。总之，正常神经功能的重新修复将成为神经干细胞移植研究的最终目的，相信神经干细胞移植会在神经系统疾病的治疗中发挥巨大作用，有望成为缺血性脑卒中治疗的重要手段。