医药学论文：HSP 70与心肌保护

心脏移植为终末期心脏病的唯一有效的治疗方法，但心脏不同于机体其他组织器官，供心从切取到移植入受体体内缺血、缺氧时间较长，而且它在植入受体后要尽快恢复功能，立即承载起全身其他脏器的供血功能，保证生命。因此，对供心的心肌保护极为重要。目前，随着临床手术技术的提高，供心热缺血时间基本可控制于6～10min，如何延长供心冷缺血时间，加强心肌保护效果，减轻心肌缺血再灌注损伤，以便从容运输和手术，甚至建立器官库，资源共享，即成为当今心脏移植的研究热点，也是影响心脏移植广泛开展的瓶颈问题。
热休克蛋白家族（HSP 70s）是目前备受关注的应激蛋白，它作为一种"分子伴侣"参与多种细胞的损伤修复，对心肌细胞同样具有保护作用。提高心肌细胞HSP 70含量的方法有两类：（1）诱导内源性HSP 70的表达；（2）导入外源性HSP 70基因。近年来实施心肌保护方面的研究多注重于调动心脏内源性的保护机制，以提高心肌细胞自身耐受缺氧的能力。本文就内源性HSP 70与心肌保护的研究进展进行如下综述。
1 HSP 70概述
1.1 HSP 70的分类及分布 热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一组高度保守的多肽，普遍存在于生物体内。HSPs研究是从观察果蝇幼虫热应激反应开始的。Ritossia等发现短期高热处理（大约高于正常体温5℃）可引起果蝇（droso Phila）幼虫唾液腺细胞的染色体发生"膨松"式（puffing）改变，提示这一区域基因的转录被激活。这种反应称为热应激反应，而在这种条件下合成的蛋白质即是HSPs。
广义的HSP包括三大类蛋白质：（1）结构性HSP（constitutive HSP），是在生理状态下固定表达并存在于非应激的正常细胞的胞液和胞核，一般与应激反应无关。（2）诱导性HSP（inducible HSP），又称应激蛋白，为狭义的HSP，仅在受到有害因素作用后产生，为高度应激诱导合成，应激时位于胞核，细胞恢复时则移入胞浆，胞核正常条件下不表达或少见合成。（3）HSP类似物（HSP cognate，HSC）。根据分子量大小，HSP主要分为4个家族：HSP90家族（83～93kD）、HSP 70（66～78kD）家族、HSP60家族及小分子HSP家族（15～30kD）。此外还有分子量在100～110kD的大分子HSPs。
目前研究较多的为HSP 70家族，是HSPs中最保守、最主要、含量最丰富的一类。包括GRP 75、GRP 78、GRP 80、HSP 68、HSP 72、HSP 73、HSC 70等。其中HSP 73又称结构型HSP 70；HSP 72又称诱导型HSP 70；GRP 78(Bip)、GRP 75为葡萄糖调节蛋白，分别固定存在于内质网和线粒体［1］。
1.2 HSP 70的分子生物学作用 HSP 70不仅参与细胞正常的生长、发育和分化而且不同的HSP 70可由不同的应激诱导，分别在各自的区域内发挥作用。HSP 70具有非特异性［2］：除热应激外，其他病理生理、物理及化学性刺激如缺血、低氧、重金属盐类、氨基酸类似物、炎症都可不同程度地诱导细胞内合成HSP 70。
HSP 70的细胞保护作用是指机体细胞在受到各种应激，如高热、氧化等有害应激时，产生的HSP 70可以增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常功能代谢，提高细胞生存率［3］。有研究显示，细胞受到应激尤其是热应激时，新合成的HSP 70约30%转位到细胞核内，其余则留在细胞浆中。转位到细胞核内的HSP72紧密聚集在含有核糖体前体颗粒区域附近及染色质和核质内，并以特殊方式与解聚染色质相互作用，对细胞核的骨架起保护作用，防止染色质和不均一RNA复合物降解而引起细胞生命信息紊乱［1］；留在细胞浆中的HSP72也发挥了结构型HSP73的功能，与变性或受损的蛋白结合使之修复。在机体应激后的恢复期内转位到细胞核内的HSP72又重新回到胞浆中，尤其是集中在核外周，似乎与中心体、微管蛋白的重新装配、胞浆中核糖体的重新分配有关。
安静状态时，HSP 70在细胞内的合成量极低，当机体受到有害刺激时，HSP 70在细胞内迅速合成，其合成量甚至能占应激组织细胞中蛋白总量的20%。合成的HSP 70具有如下生物学作用：（1）影响免疫效应和自身免疫形成，调控细胞免疫反应［4］。当刺激因素引起细胞免疫应答时，不但有各种细胞因子（IL1、IL2、TNFα等）产生，同时亦伴有HSP的产生，以对抗细胞因子对细胞的损害作用。冉擘力等［5］发现，HSP72表达增加可使细胞黏附分子ICAM1表达减少，从而减少炎性介质浸润，产生心肌保护作用。（2）抗氧化作用，包括两方面：一方面HSP通过抑制产生氧自由基的关键酶即NADPH氧化酶，反馈减少氧自由基的产生；另一方面HSP可增加内源性过氧化酶如超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）的水平，从而清除氧自由基，保护细胞。（3）交叉耐受性：机体或细胞经历一次短暂、轻度的热应激反应后，不仅对其后重度热应激产生耐受性，使细胞的存活率增加，而且对其他重度损伤（如重度缺血、低氧等）刺激产生耐受性。（4）分子伴侣作用（molecular chaperone）：这也是HSP 70最受关注的主要作用。所谓分子伴侣是指细胞内一类能介导其他蛋白正确装配，其自身却不是具有功能的最终装配产物组成成分的物质。ATP依赖的HSP 70与大量的非天然蛋白质作用，能促进新生多肽链的正确折叠，协助新生蛋白质的装配、合成和调整，使其形成正确的三维空间结构，维持蛋白质合理构象；对分子重排、蛋白质解聚和新生多肽的跨膜转运具有辅助作用［6］，HSP能够和一些细胞中的蛋白质结合，并帮助这些蛋白质穿过内质网腔。当这些蛋白质在细胞内转移完成后便与HSP解离，折叠弯曲成最终的形式［7］。（5）作为一种内源性保护物质对脏器损伤产生自身保护作用［1，6］：HSP 70可通过激活某些酶的作用而减少细胞凋亡。（6）对其他HSPs的功能有辅助作用。（7）HSP 70具有稳定细胞膜结构，防止蛋白质变性等功能［8］。
总之HSP 70为修复损伤所必需，它能激活Na+-K+-ATPase活性，恢复膜功能，能促进细胞色素C传递电子以加快细胞的恢复。
2 HSP 70在心血管系统中的表达及心肌保护作用
2.1 HSP 70在心肌表达增加的诱导因素 目前，已知诱导心肌组织合成HSP 70的因素可分为外源性和内源性两类。外源性因素主要为热应激，此外还包括酒精、氨基酸类似物、过氧化砷中毒等。而内源性因素包括［9］：（1）急性高血压：给大鼠静脉注射血管紧张素Ⅱ、内皮素、去甲肾上腺素等血管收缩剂以及心脏后负荷的增加均可诱导大鼠心肌组织合成HSP 70；（2）心肌缺血-再灌注：是目前研究的热点。HSP 70在正常心肌很少表达，而在冠脉阻塞或再灌注时则快速表达［10］。许多实验研究表明，心肌短暂缺血z可刺激HSP 70表达增加，可对抗再灌注时不可避免的心肌细胞损伤。心肌缺血-再灌注引起的病理生理变化包括代谢抑制、血流动力学改变、氧自由基释放及蛋白质变性等。因此，心肌缺血再灌注促HSP 70的生成是由多种因素造成的；主要原因可能为氧自由基产生扰乱了蛋白质代谢，产生了分子作用的底物，从而导致热休克转录因子-1（heat shock transcription factor，HSF1）激活，诱导HSP 70产生和HSP 70 mRNA基因的表达［11］。（3）低氧：实验结果表明，在心肌细胞缺氧12h，HSP 70表达已十分明显，24h达高峰。心肌组织能量消耗大，对代谢应激十分敏感。由于心肌细胞为终分化细胞，损伤后的代偿不能通过细胞的分化而发挥作用，缺氧诱导的心肌细胞HSP 70产生，可能是心肌细胞对缺氧产生的一种细胞修复及抗损伤的代偿机制，同时也可能是一种早期损伤的标志。（4）活性氧类（reactive oxygen species，ROS）：Nishizawa等［11］报道，在离体大鼠心脏的灌流液中加入H2O2或加入黄嘌呤（xanthine）与黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）（产生O2-和H2O2）后，HSF与热休克元件（heat shock element，HSE）的结合力明显增强，HSP 70 mRNA的表达丰度明显增加。而在灌流液中加入活性氧的清除剂（allopurinol或catalase）能明显降低缺血-再灌注时HSF与HSE的亲和力。此时行缺血-再灌注，引起HSP 70 mRNA表达的增加也受到抑制，由此说明缺血-再灌注引起活性氧的释放可能是诱导心肌组织合成HSP 70的主要因素。另外，各种病理因素导致的心肌细胞骨架的紊乱、中性粒细胞在心肌损伤区的聚集和溶酶体酶的释放、细胞外蛋白激酶的激活以及补体系统的激活都是触发心肌合成HSPs的因素［2］。
2.2 HSP 70心肌保护的作用及机制 20世纪80年代人们发现HSP 70能保护缺血心肌［12，13］。1988年Currie等［12］首次报道了热处理能保护缺血心肌的现象，同时有HSP 70的增多。热处理亦能缩小心梗范围［14］。然后，人们开始研究HSP 70在缺血预处理中（IPC）的表达及在缺血-再灌注中的心肌保护作用。许多实验证实HSP 70 mRNA表达在IPC时明显增加，用放线菌素-D（actinomycin-D）及环己米特放线菌酮（cycloheximide）分别阻断了HSP 70基因转录及翻译，阻止HSP 70合成，完全阻断了对大鼠心肌的保护作用［15］。直接将HSP 70基因转录入大鼠心肌细胞能显著地增加其抗I/R损伤的能力［16］。Trost等［17］发现HSP 70的表达能保护和改善缺血后的心脏功能。
动物实验及临床研究发现：当各种原因导致心肌缺氧时，在心肌细胞内可检测到HSP 70蓄积，其含量明显增多，它主要分布在细胞核内。该蛋白的表达是心肌细胞对缺氧损伤产生的重要内源性防御反应。这些分子伴侣的合成增加对缺氧、缺血等损伤有一种暂时的强烈耐受，尤其是HSP 70、HSP 72的作用非常明显［18］。慢性缺氧时，HSP 70 mRNA和蛋白质在细胞内的分布受蛋白激酶C（PKC）和丝裂原激活酶P38，特别是丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（亦称为应激活化蛋白激酶，JNK）的调节，通过这些信号转导途径对心肌慢性缺氧应激起适应性保护作用［19］。
正常情况下，HSP以可溶性形式存在于细胞质中，细胞受到缺氧刺激后，HSP 70转移至细胞核内，可以降低缺氧、复氧时蛋白酶活化受体（PARS）的活性，增强细胞存活能力，从而起到对抗缺氧、复氧损伤、保护心肌细胞的作用［20］。
HSP是一种保护心肌细胞、对抗心肌损伤的重要应激蛋白，其作用机制主要归纳为：（1）参与离子通道修复、恢复氧化还原平衡、阻止凋亡途径启动等保护内皮［21］。（2）HSP 70除直接导致细胞抗氧自由基酶活性增加，减少氧自由基释放外，还可作为分子伴侣保护MnSOD和CAT等细胞内的抗氧自由基酶免受损伤，从而达到清除自由基的作用。实验发现，缺血再灌注能引起HSP 70和MnSOD等抗氧化基因的激活。在果蝇中也发现SOD RNA水平的增高与HSP 70m RNA表达的增高相一致。（3）稳定细胞膜和溶酶体膜，防止蛋白质变性，减轻心肌的缺血再灌注损伤。（4）促进变性蛋白质的复性水解，维持蛋白质的结构，促进新合成的蛋白质取代老化蛋白质［22］，并可以保持正常或部分变性蛋白的四级结构，协助大分子蛋白或肽从线粒体和内质网的跨膜转运，从而保护缺血的细胞［23］。（5）HSP 70还可抑制细胞因子的炎症反应，起一定的非特异免疫保护作用。
3 HSP 70与心脏移植中供心冷缺血期间的心肌保护
目前，心脏移植作为终末期心脏病的治疗方法，已被广泛接受。它不同于日常心脏手术，供心的缺血从切取心脏时阻断主动脉开始，包括心脏切取、运送、修剪至移植完成后主动脉开放，缺血时间长；移植后的心脏必须马上承担受体全负荷的工作；而且供心迷走、交感神经调节功能丧失，移植后的心脏主要靠体液作用于心肌的功能，因此供心的保护极为重要，要求极高［24］，已成为影响手术经过、决定移植后生活质量的重要因素。
心脏生理和功能的特点，决定了供心保护的复杂性和困难性，它不同于其他脏器，一方面心脏必须在再灌注时就恢复其90%的功能来承担受体全负荷的工作以维持生命，其他脏器可以允许有数小时至数天来恢复，另一方面心脏在功能和代谢上与其他脏器有很大差别，这种差别表现在心脏不仅是高能量依赖的器官，而且具有收缩功能［25］。心脏有大量的肌动蛋白和肌球蛋白，当低温保存造成心肌中ATP缺乏时，肌动蛋白和肌球蛋白相互作用形成的横桥就会因为缺乏能量而不能打开，使心脏发生进行性不可逆的收缩，有学者报道这种现象时，将这种心脏称为"石样心"。
供心冷缺血时间是指供体主动脉阻断至受体主动脉开放的一段时间，包括取心所需时间，检查修剪、盛装储存、运输时间及心脏移植时间，许多脏器均可承受24～48h的冷缺血，如肝、肾、脾等，但心脏的安全保存时间仍不超过4～6h［26］。供心移植后的再灌注损伤仍然是移植心脏早期功能衰竭和受体死亡的一个重要原因［27］。近年来研究发现，心脏移植的再灌注损伤与氧化应激所致的能量代谢障碍密切相关。移植心肌缺血再灌注时，由于组织缺氧、呼吸链抑制、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）堆积、儿茶酚胺增多和游离脂肪酸堆积，使得心肌细胞膜脂质的分子氧不能完全还原，而经加氧酶系产生大量自由基。大量的氧自由基攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸，引起膜脂质过氧化，线粒体肿胀、溶解，多聚核糖体解聚、脱落及溶酶体外漏、胞内钙离子超载、促凋亡基因（P53、ced-4等）上调、导致心肌细胞凋亡［28］。同时由于组织缺氧、脂肪酸氧化障碍致使胞质中长链脂肪酰CoA堆积，抑制线粒体内膜腺苷转位酶的活性，使线粒体氧化磷酸化过程受阻，ATP产量减低，从而造成心肌能量代谢障碍［29，30］。Belzer等研究了低温下器官的各项生理改变，指出离体心脏保存应达到以下标准：（1）降低组织水肿；（2）防止细胞内酸中毒；（3）减少再灌注时氧自由基的损害；（4）防止灌注时组织间隙的扩大；（5）在再灌注时提供合成高能磷酸化合物的底物［31］。
目前国内外正积极研究利用HSP 70保护心肌细胞，缺氧诱导产生的HSP 70的抗氧化、清除自由基、防止细胞凋亡等各种作用已被证实。
供心的保存效果评价及保存时间长短主要取决于心脏移植后的再灌注损伤，在供心的离体冷缺血保存期间，良好的心肌保护可极大地减少心脏移植后的再灌注损伤。已有的研究主要集中于两个途径加强供心保护：（1）于心肌保存液中增加各种对抗心肌损伤的物质，增加各类心肌保存液的保存效果，延长供心的缺血时间，减少心肌细胞缺血再灌注损伤。（2）利用药物预处理诱导心肌细胞表达HSP 70，减轻心脏移植后在受体中的再灌注损伤。前者由于是人为参与模仿心肌电生理活动，毕竟与心肌本身生理状态不同，势必会在保护心肌细胞的同时又产生一些副作用；而后者则不存在上述缺点，具有临床研究意义。
综上所述，作为一种重要的分子伴侣，HSP 70的心肌保护作用已被较多的实验研究证实，而药物预处理作为一种诱导心肌细胞表达HSP 70的有效手段，在对抗各种原因所致的心肌缺血再灌注损伤方面更具有临床应用前景。心脏移植的供心来源有限，如何通过各种途径利用HSP 70的心肌保护作用延长供心离体保存时间，是合理利用有限的资源，推动心脏移植广泛开展的关键问题，值得临床进一步研究探讨。