医药学论文：RhoA基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义*

【摘要】 目的 探讨RhoA基因与肝细胞癌的发生、发展和侵袭、转移的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在半定量水平检测42例肝细胞癌及其相对应的癌旁肝组织中RhoA mRNA的表达，同时采用PCR产物单链构象多态性（PCR-SSCP）银染法检测RhoA基因的突变情况。结果 本组42例肝癌组织中RhoA mRNA光密度相对值明显高于癌旁肝组织（P< 0.01）；有门静脉癌栓者其癌组织中RhoA mRNA光密度相对值明显高于无癌栓者（P< 0.05）。经PCR-SSCP银染法分析未发现异常泳动条带。结论 RhoA基因在肝细胞肝癌进展中起重要作用，并可能与肝癌转移相关。
【关键词】 肝癌；RhoA；基因表达；RT-PCR
【Abstract】 Objective To investigate the expression of RhoA gene in hepatocellular carcinoma and to evaluate the relationship between RhoA gene expression and invasion of hepatocellular carcinoma.Methods The mRNA expression of RhoA gene was examined by RT-PCR in 42 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent non-cancerous tissue.In addition，the mutation of RhoA gene was examined by PCR-SSCP.Results The opacity density (OD) of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissues (P< 0.01）.The OD of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma with intrahepatic metastasis was significantly higher than that without intrahepatic metastasis (P< 0.05）.Mutation was not found in RhoA gene by PCR-SSCP examination.Conclusion The RhoA gene may be related to malignant transformation and development of hepatocellular carcinoma probably by overexpression.
【Key words】 hepatocellular carcinoma；RhoA；gene expression；RT-PCR
原发性肝癌发生率高，手术切除是目前最主要的治疗方法。尽管随着影像诊断和外科技术的进步，尤其是肝移植在肝癌中的运用，肝癌的预后已经有所改善，但肝脏的特殊解剖结构和功能决定着肝癌术后复发率高，术后复发已成为影响患者预后的主要问题。肝癌侵袭转移是主要的影响因素之一，深入研究肝癌侵袭转移机制对于改善肝癌患者的总体预后有重要作用。Rho蛋白和肿瘤发生有密切的关系，参与肿瘤的浸润和转移过程。Rho家族属于Ras超家族，是重要的细胞内信号分子，在细胞的许多基础生命活动中起关键的作用［1］。目前研究证实，Rho蛋白特别是RhoA在肿瘤发生、发展中起重要作用，在结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌等均报道有RhoA表达的异常增高［2］。本研究利用RT-PCR技术及分子定量成像系统分析42例肝细胞肝癌（HCC）病人的肝癌组织及癌旁肝组织中RhoA mRNA的表达，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂及仪器 RT-PCR试剂盒购自MBI公司；dNTP及DNAmarker购自Promega公司；琼脂糖、TRIzol试剂及DEPC购于Gibco公司。凝胶成像系统购自美国Genesis公司；UV-3000型紫外分析仪购自上海天能科技有限公司；PE-2400TMPCR仪购自美国Perkin。
1.1.2 标本来源 42例患者的原发性肝癌组织及相对应的癌旁肝组织来自第四军医大学附属第一医院2004年8月～2005年3月的新鲜手术标本，离体后30min内分装保存于液氮罐中，所有病例均附癌旁肝组织作为对照，分别伴有慢性炎症、纤维化和肝硬化，全部标本均经病理科医师切片确诊。
1.2 方法
1.2.1 扩增引物设计 以GenBank中人RhoA基因全长序列为模板，按引物设计原则予以设计，采用Primer premier 5.0软件设计，其序列如下（U，D分别表示上游和下游引物）：RhoA U1 5'CTGGTGATTGTTGTTGGTGATGG3'，U2 5'GATTCGTTGCCTGAGCAATG3'，D 5'GCGATCATAATCTT-CCTGCC3'。Bactin引物序列：上游引物，5'CGGGAAATC-GTGAT3'；下游引物，5'GAACTTTGGGGG ATGCTCGC3'。其中U1、U2为RhoA上游引物，分别用于定量RT-PCR和PCR-SSCP，D为下游引物。RhoA产物分别为183bp和221bp。
1.2.2 总RNA提取 组织总RNA的抽提取：0.5g组织块，加入Trizol试剂1ml，在电动玻璃匀浆器中，充分匀浆。将全部匀浆液转入1ml离心管中，加0.25ml氯仿，充分振荡混匀，冰浴15min。低温 13000r/min离心15min。小心吸取上层水相至另一1.5ml离心管中，注意不要吸到蛋白层或有机相，加等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min，低温13000r/min离心15min，沉淀RNA。加70%酒精漂洗沉淀，5000r/min，离心10min，小心弃去酒精，空气中干燥10min。经电泳证实有两条明显的18S及28S条带，用紫外可见分光光度仪检测RNA的纯度及含量。
1.2.3 RT-PCR扩增RhoA mRNA及鉴定 cDNA制备：应用逆转录试剂盒，总RNA投入量为2μg，使用随机引物。第一链cDNA合成后终体积10μm，具体方法按说明操作。RhoA与Bactin反应同管进行，反应终体积为50μl，反应条件为94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，共25个循环。PCR产物在含0.5g/ml溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶上电泳，应用凝胶成像系统对条带进行扫描分析。利用分析软件计算并比较每一对样品中RhoA mRNA与B-actin的光密度的相对比值，从而获得每对样品中肝癌组织及癌旁肝组织RhoA mRNA表达的相对含量。
1.2.4 PCR-SSCP分析 PCR反应试剂基本同前，仍用cDNA模板，改用U2和D引物扩增RhoA基因，反应条件为94℃ 1min，57℃ 2min，72℃ 1min，共扩增30个循环。扩增产物变性后行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察泳动条带是否异位以判断突变情况。
1.3 统计学方法 所有数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS10.0进行分析，组间比较用Student's t检验，P< 0.05表示有统计学意义，P< 0.01表示有显著的统计学意义。
2 结果
将各样品RT-PCR产物经分子定量成像系统分析，以Bactin条带为内参照，其光密度值设定为1.000，计算RhoA mRNA表达的相对丰度。肝癌组织中RhoA mRNA光密度相对值为（0.276±0.069）；癌旁肝组织中为（0.137±0.058）；两者差异有非常显著性（P< 0.01）。有门静脉癌栓者共17例，其癌组织中RhoA mRNA光密度相对值为（0.316±0.107），无肝内转移灶者为（0.241±0.097）；两者差异有显著性（P< 0.05）。