医药学论文：FAK的阻断对MHCC97肝癌细胞侵袭性的影响

【摘要】 目的 通过对MHCC97肝癌细胞株的FAK基因的表达进行干预，观察MHCC97肝癌细胞侵袭转移能力的变化。方法 用Oligofec TAMINE介导的方法，将反义FAK ODN引入MHCC97肝癌细胞株，或用Genistein抑制MHCC97肝癌细胞FAK磷酸化方法，观察经过不同干预后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的活力变化，比较MHCC97肝癌细胞转染反义FAK ODN前后和用Genistein抑制磷酸化前后，细胞侵袭转移能力的变化。结果 反义FAK ODN转染的肝癌细胞和用Genistein干预的肝癌细胞穿过Matrigel胶的能力减弱。结论 抑制FAK的表达能影响肝癌细胞的侵袭转移能力。
【关键词】 FAK；肝癌细胞；侵袭
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effects of antisense focal adhesion kinase (FAK) oligodeoxynucleotides(ODN) and Genistein on the invasion of MHCC97 hepatocellular carcinoma cells.Methods Oligofec TAMINE-mediated antisense FAK ODN was transfected and Genistein was added into MHCC97 hepatocellular carcinoma cells.The invasive activity of tumor cells was assayed in a transwell cell culture chamber has been dealed with Matrigel first.Compare the changes between them.Results Antisense FAK ODN and Genistein can both decrease the invasion of MHCC97 hepatocellular carcinoma cells.Conclusion Inhibition of FAK expression can inhibit the invasion ability of MHCC97 hepatocellular carcinoma cells.
【Key words】 FAK；hepatocellular carcinoma cell；invasion
肝癌严重威胁着人类的健康，在中国肝癌的发病率一直呈逐年上升趋势。我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌年死亡总数的45%。肝癌的侵袭转移性高是其治疗失败的主要原因。尽管目前对肝癌的治疗，无论是在手术还是在局部或全身的辅助治疗（包括放疗、化疗）措施上都取得了很大的进步。但仍难以控制其在局部和远处的转移。因此发展新的治疗策略具有十分重要的意义。从细胞、分子及所组成的网络结构认识细胞信号转导通路异常在肝癌细胞侵袭转移中的作用。为肝癌的防治提供新的思路。
本文中我们通过反义FAK ODN转染和Genistein抑制FAK磷酸化分别对MHCC97肝癌细胞FAK的表达进行不同干预，探讨受干预后的MHCC97肝癌细胞的侵袭力的变化。
1 材料与方法
1.1 实验材料 MHCC97肝癌细胞株由上海医科大学附属中山医院肝癌研究所提供。Oligofec TAMINETMReagent购于Invitrogen公司。Transwell小室购于美国Corning Costar公司。Genistein(4、5、5-Trihvdroxyisoflayone FW：270.2)和二甲基亚砜（DMSO）共同购于Sigma公司。Matrigel胶购于BD Biosciences公司。
1.2 Oligofec TAMINE 介导的反义FAK ODN 转染 反义FAK ODN 5'-ATAATCCAGCTTGAACCAAG-3'。由上海生工生物工程公司DNA合成，全硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，冻存。Oligofec TAMINE按产品说明书介导转染培养细胞。对照组只加入脂质体不加入反义FAK ODN。
1.3 Genistein抑制FAK磷酸化 以10μg/ml的终浓度加入细胞培养液中，并使DMSO终浓度为0.4%。实验对照组以同样终浓度为0.4%的溶剂处理。
1.4 细胞体外侵袭能力检测法 Transwell小室是目前常用的Matrigel胶重建基底膜系统，是体外研究肿瘤细胞侵袭和转移行为的简便和快速有效方法。聚碳酸滤膜（8μm孔径）黏附于Transwell小室后，以50μl含5μg纤维连接蛋白（fibronectin，FN)的PBS处理Transwell小室的聚碳酸滤膜下表面，室温下过夜干燥。Matrigel用含0.1%小牛血清的培养基稀释成100μg/ml，加入滤膜上表面（5μg/滤膜），室温下通风橱中干燥过夜。用前Matrigel以40μl无血清培养基重建20min后备用。将行不同预处理后的细胞用无血清培养基洗3次，0.25%胰蛋白酶消化，重悬于含0.1%BSA的培养基中，取2×106/ml细胞100μl加入至上室，600μl 0.1%小牛血清培养基加入下室。37℃、5%CO2条件下培养20h后，滤膜用甲醇固定5min，行Gimsa染色。去除滤膜上层细胞，显微镜下（×320）计数滤膜下表面细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复2次，实验重复2次，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。
1.5 统计学方法 采用t检验。
2 结果
我们发现转染反义FAK ODN和经Genistein处理后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的能力下降，提示细胞的侵袭力减弱，见表1。