医药学论文：微丝功能对内皮细胞损伤修复的影响

【摘要】 目的 观察内皮细胞在损伤修复过程中微丝骨架系统的形态结构变化，研究阻断微丝功能对内皮细胞损伤修复的影响。方法 以培养单层内皮细胞损伤模型，采用免疫荧光染色和3H-TdR掺入法，研究微丝功能对创面愈合及细胞增殖的影响。结果 内皮细胞在损伤修复过程中伴随微丝特殊而有序的变化。用细胞松弛素Ｂ破坏微丝，可不同程度抑制创面的愈合及细胞增殖，并呈一定的时间-剂量依赖关系。结论 微丝功能在内皮细胞修复过程中起重要作用，可通过直接或间接效应影响DNA合成，从而影响修复过程。

【关键词】 内皮细胞 创伤愈合 细胞骨架

Effects of microfilaments on the repair of endothelial monolayers wound

 

【Abstract】 Objective To observe the morphological changes of microfilaments，and to investigate the wound closure and cell proliferation after the disruption of microfilaments.Methods An in vitro wound model，immunofluorescence microscopy and 3H-TdR incorporation methods were used in this study.Results A specific and sequential changes in microfilaments occourred during wound healing. When the microfilaments were disrupted with cytochalasin B ，the wound closure and cell migration were greatly delayed.The endothelial cell 3H-TdR incorporation was also inhibited，which showed time and dose dependent relationship.Conclusion These results suggest that the microfilement system might be critical to wound healing， and the cytoskeletal system might directly or indirectly participate in the regulation of cell proliferation and wound healing.

【Key words】 endothelial cell wound healing cytoskeleton

创伤修复是一个复杂的生物学过程，许多因素参与了这一过程的调节。研究表明，细胞骨架系统（cytoskeleton system）不仅决定细胞的形态和运动，还参与控制细胞的生长、分化及细胞内外的信息传递［1］。因此在创伤修复过程中细胞骨架系统可能起着重要作用。微丝系统是细胞骨架的主要成分，本实验拟采用体外培养单层内皮细胞损伤模型，观察微丝在损伤修复过程中的相应变化，以及阻断微丝功能对损伤修复过程及细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及模型建立 参考文献的方法分离和培养人脐静脉内皮细胞［2］，以含20％FCS的DMEM（Gibco）液每2d换液1次。创伤模型的建立参考文献报道［3］，内皮细胞接种在含盖玻片的24孔培养板内，生长汇合成单层内皮细胞后，去除盖玻片中央1.5mm内皮细胞，制成创面。用装有网格测微计的倒置相差显微镜观测创面闭合速度，并计算某时刻创面闭合指数100×［1-(某时刻创缘间宽度/原始创缘间宽度）］。创缘间距离取３处不同点测量，重复３次，取平均数。

1.2 细胞处理 内皮细胞生长汇合成单层内皮细胞后，分为实验组和对照组，每组每种浓度复设12孔。实验组分别在损伤前1h各加入终浓度为0.2μg/ml、0.4μg /ml、0.8μg /ml和1.2μg /ml的细胞松弛素Ｂ（Sigma公司），对照组加等量的培养基。该药物于使用前用含20％FCS的DMEM配制，每2d换液1次并加相应浓度的细胞松弛素B。分别记录不同浓度药物作用下创面闭合速度和时间，以及不同时刻创面闭合指数。

1.3 微丝的荧光染色 分别于损伤前、损伤后不同时间取出培养板内的盖玻片进行染色。以4％多聚甲醛+TritonX-100固定10min，0.1M甘氨酸处理10min，加rhodamine-phalloidin（1∶20，Molecular Probes）染色40min，PBS冲洗3次×3min，加甘油/PBS（1∶1）封片，荧光显微镜观察、拍照。

1.4 3H-TdR掺入量测定 用含20％FCS的DMEM悬液以0.2×105/ml细胞密度接种于24孔板，培养至汇合，换成无血清DMEM培养24h后分为实验组和对照组，每组每种浓度复设12孔。实验组于损伤前1h每孔加浓度为1.2μg /ml的细胞松弛素Ｂ，而对照组于损伤前后不加药物，分别于损伤后8h、24h及48h收集样本。在收集样本前4h加1μci/孔的3H-TdR。自动液闪烁记录仪测定样本3H-TdR的每分钟脉冲数（CPM）。

1.5 统计学方法 数据以(x±s)表示，并对数据进行方差分析和t检验。