医药学论文：人源M2三联体靶抗原BPO

［摘要］ 目的 用基因工程的方法克隆表达抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的3个靶抗原侧链二氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）及其连接形成的三联体BPO-E2融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断。方法 针对BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的cDNA序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取RNA，通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pET28a（+），构建重组表达载体pET28a(+）-BCOADC-E2、pET28a(+)-PDC-E2、pET28a(+)-OGDC-E2、pET28a(+)-BPO-E2，转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western-blot等鉴定。结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了4种重组质粒。IPTG诱导表达后，获得4种融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性。结论 重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验室诊断。
［关键词］ 肝硬化，胆汁性；自身抗原；重组融合蛋白质类
cDNA cloning and expression of autoantigen BPO-E2
［Abstract］ Objective To express BPOE2 recombinant fusion protein in E.coli.in order to be used in early diagnosis of PBC.Methods The cDNA encoding BCOADC-E2，PDC-E2 and OGDC-E2 were obtained by RT-PCR，confirmed by DNA sequencing，subcloned unidirectionally into the bacterial expression plasmid pET28a(+) and then transformed into E.coli.，BL21(DE3) to express the recombinant fusion protein induced by IPTG.Results The recombinant fusion protein exhibited the antigenicity of AMA-M2 by western blotting.Conclusion The BPO-E2 recombinant fusion protein could be used for diagnosis of PBC.
［Key words］ liver cirrhosis，biliary;autoantigens;recombinant fusion proteins
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC)是一种以肝内中、小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征，最终导致肝硬化和肝衰竭的典型自身免疫性疾病（AID）［1，2］。在PBC患者体内可检出多种自身抗体，如抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）、抗平滑肌抗体（SMA）、抗肝肾微粒体抗体（LKM）等，其中最主要的抗体是AMA［3，4］。AMA分为M1～M9共9个亚型，而只有M2为PBC特异抗体。AMA-M2抗体对PBC检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达100%［5］。M2抗体的靶抗原为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复合体（2-OADC）的一些组分：丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）等。笔者用基因工程的方法表达BPO-E2融合蛋白，为PBC的早期发现和特异性诊断提供有效手段。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 血清标本 22例血清来源于我院住院病人，经德国Euroimmun公司免疫印迹试剂盒测定，M2抗体为阳性。
1.1.2 主要试剂 反转录酶、PCR扩增试剂盒、RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。pET-28a（+）质粒及大肠杆菌BL21（DE3）购自Novagen公司。间接免疫荧光法测定AMA试剂盒购自Euroinmun公司。
1.1.3 引物 参照人BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2全序列，设计引物。BCOADC-E2正向引物：5-ATCGCATCCGCACAGGTTGTTCAGTTCAT-3；BCOADC-E2反向引物：5-TAATTTTTGCA TGCACGGCGAACTGCAGGAGT-3。PDC-E2正向引物：5-TTCGCCGTGCAAAAATTAT ACACTGGTATCCTG -3; PDC-E2反向引物：5-ACAGCTGTGAGCTCTAAATCTGTTACTTCGGTTG-3。OGDC-E2正向引物：5-CAGATT TAGAGCTCACAGCTGTATGCAAGGATGA-3；OGDC-E2反向引物：5-ATCGCGTCGACAGGAGCAGCACCATG TTTCC-3。
1.2 方法
1.2.1 基因克隆操作 用淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离单个核细胞，得到的白细胞抽提RNA，反转录得到cDNA。pET-28a（+）质粒分别用BamH1和Sph1、Sph1和Sac1、Sac1和Sal1、BamH1和Sal1双酶切后，经T4DNA连接酶的作用将BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、BPO-E2的cDNA对应定向插入其中。送上海生工生物工程技术公司测定序列进行鉴定。PCR扩增反应条件为94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后再进行72℃延伸5min。
1.2.2 重组质粒的转化和鉴定 将重组质粒用氯化钙转化法导入宿主菌BL21（DE3），加入LB培养液37℃震荡培养45min后涂布于LB平板上（含终浓度100μg/ml卡那霉素）培养过夜。抽提质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳观察重组质粒和酶切后的产物，见图1。