医药学论文：体外培养的人鼻腔黏膜纤毛摆动频率的测量

【摘要】 目的 为人鼻腔黏液纤毛运输系统的研究提供科学有效的方法。方法 人鼻腔黏膜的组织块培养法，应用显微高速成像技术测量纤毛摆动频率。结果 在25℃，体外培养的人鼻腔黏膜纤毛摆动频率是10.39±1.80Hz；同一细胞任意两点纤毛摆动频率是相同的；同一来源的体外培养的钩突和下鼻甲的纤毛摆动频率是相同的。结论 钩突可成为今后人鼻腔纤毛系统的研究的主要标本来源。
【关键词】 人鼻腔上皮细胞；纤毛摆动频率；钩突
Ciliary beat frequency measurement of cultured human nasal epithelial cells
【Abstract】 Objective To explore a scientifical method to research human mucociliary system.Methods Explant culture of human nasal epithelial cells. Ciliary beat frequency was measured by digital high-speed microscope. Results Ciliary beat frequency of cultured human nasal epithelial cells is 10.39±1.80 Hz at 25℃. Ciliary beat frequency of different cilia is equal on the same cell， it is also equal from uncinate process and inferior turbinate. Conclusion Mucosa of uncinate process is the main source to research human nasal mucociliary system.
【Key words】 Human nasal epithelial cells；ciliary beat frequency；uncinate process
呼吸道黏液纤毛运输系统为呼吸道防御系统的第一道防线，可将进入呼吸道的灰尘等异物排出体外，它是呼吸道能否发挥正常生理功能的重要保障［1］。相邻纤毛的协同运动构成了特有的异相波（metachronal wave）来推动黏液的运输，纤毛摆动频率（ciliary beat frequency，CBF）是反映纤毛运动功能的主要指标，也是反映呼吸道黏液纤毛运输系统功能是否正常的重要指标。因而纤毛摆动频率的测量对了解黏液纤毛运输功能有着非常重要的意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源 人鼻腔钩突和下鼻甲黏膜。
1.2 主要试剂 培养基选择达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle medium， DMEM）；Hanks平衡盐溶液（Hanks' balanced salt solution， HBSS）；羟乙基哌嗪乙磺酸［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid， HEPES］。
1.3 试验器械和仪器 直径15mm的圆形盖玻片；CO2培养箱；倒置式研究型显微镜；高速数码摄像采集系统：包括高速数码摄像机、图像捕捉卡、图像采集软件和图像灰度分析软件。
1.4 方法
1.4.1 人鼻腔纤毛上皮细胞的组织块培养 采用改良的Dirksen，Zhang等介绍的方法［2，3］。无菌操作下取人鼻腔钩突和(或)下鼻甲黏膜，在解剖显微镜下分离黏膜，去除黏膜下组织，把分离好的黏膜面向上，切成0.5～1mm2的组织块，种植在铺有鼠尾胶原的盖玻片上，加入DMEM/NaHCO3，放入37℃含5％CO2的孵箱中，隔日换液1次，培养6～10天时可以进行观察。
1.4.2 应用数字化高速显微摄像系统测量体外培养的人鼻腔纤毛摆动频率 观察培养好的纤毛上皮细胞的纤毛摆动频率，把盖玻片从培养板中取出，放置在载物台上特定的加药槽内，加入sHBSS，倒置相差显微镜下放大400倍进行观察，培养的人鼻腔纤毛上皮细胞的图像（如图1）通过高速数码摄像采集系统输入小型计算机工作站，每秒钟可采集240帧图像，每次采集3秒钟，通过特定的软件对纤毛中段3×3像素的区域（见图1）进行分析，通过分析所选区域的灰度值变化，计算纤毛摆动频率。
1.4.3 测量同一细胞不同部位两点的纤毛摆动频率 随机抽取体外培养的人鼻腔纤毛上皮细胞25个，选取同一细胞不同部位纤毛中段的任意两点，测量其纤毛摆动频率。室内温度控制在约24℃。

图1 倒置显微镜下纤毛上皮细胞图像×400，白色网格分隔的是纤毛上皮细胞，左侧细胞纤毛上的白色区域为所选择分析区域（3×3像素），右下角的横线代表5μm
随机对照设计，统计学方法选用配对样本t检验，P< 0.05。