医药学论文：雌黄三硫化二砷诱导HL

【摘要】 目的 研究雌黄（As2S3）能否诱导急性粒细胞白血病细胞株（HL-60）凋亡与坏死。方法 以不同浓度的As2S3在不同的时间处理体外培养的HL-60细胞株，应用细胞生长测定、形态学观察及流式细胞仪检测等多种方法，在体外研究As2S3对HL-60细胞凋亡和增殖抑制的作用。通过对细胞进行Annexin V和碘化丙锭（PI）双重染色，应用流式细胞仪可以区分活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。结果 2.5μmol/L As2S3作用18h后诱导HL-60小部分细胞凋亡和大部分细胞坏死，7.5μmol/L As2S3作用8h后可引起HL-60细胞凋亡。结论 As2S3可诱导HL-60细胞凋亡与坏死，有必要进一步探索其对急性粒细胞白血病治疗的价值。
【关键词】 雌黄(三硫化二砷)；HL-60细胞；凋亡
Experimental study on As2S3 (Orpiment) induced apoptosis and necrosis of human leukemia cell line HL-60
【Abstract】 Objective The current study was designed to investigate whether As2S3(Orpiment) will induce apoptosis and necrosis of human acute myloid leukemia cell line HL-60. Methods Acute leukemia cell line HL-60 was used as in vitro model. HL-60 cell line was treated with As2S3 at different concentrations and different period，and cell growth was analyzed with trypan blue exclusion. Apoptosis was assessed with cell morphology （including microscope and electron microscope）and flow cytometry，the latter can distinguish live cell，apoptotic cell and necrotic cell through double staining of Annexin V and propidium iodide，of which fluorescent intensities were measured on flow cytometry.Results 2.5μmol/L of As2S3 could induce most of cell HL-60 necrosis and a small part of cell apoptosis within 18h，7.5μmol/L As2S3 could induce apoptosis of human leukemia cell line HL-60 within 8 hours.Conclusion It is necessary to study further the therapeutic value of As2S3 on acute myloid leukemia. Since it can induce apoptosis and necrosis of HL-60 cell.
【Key words】 As2S3 (Orpiment)；HL-60 cell；Apoptosis
近年来对急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗方面的有关研究取得了重大进展，全反式维甲酸、三氧化二砷以及复方青黛片（主要成分为As4S4）对APL治疗均有较高完全缓解率，尤其后两者对APL治疗作用，主要是通过凋亡来实现的［1］，因此诱发细胞凋亡已成为白血病治疗的新思路。本研究旨在进一步探索中药雌黄(又称黄砷，主要成分为As2S3)在体外对急性粒细胞性白血病细胞株HL-60的凋亡与坏死作用。
1 材料与方法
1.1 制剂 As2S3（上海化学试剂公司）配成500μmol/L的储存液，过滤灭菌，4℃存放备用，临用前稀释成所需浓度。
1.2 细胞培养及细胞生长状况测定 HL-60细胞（由江苏省血液研究所陈子兴教授惠赠）细胞以2×105/ml接种于RPMI1640培养液（10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）中培养（37℃、5%CO2）。加药后逐日取药物处理组与对照组细胞台盼蓝染色，光镜下计数活细胞总数连续6天，绘制生长曲线。
1.2.1 细胞形态观察及流式细胞仪测定 培养细胞经3.0μmol/L As2S3孵育一定时间后收集2×106细胞PBS洗2遍，1500r/min离心5min，弃上清，4℃2%戊二醛固定72h后，1%锇酸固定，梯度脱水，EPON-812包埋，超薄切片，铀和铅双重染色后透射电镜下观察。Annexin-V标记 按Immuno-tech公司的说明书进行，1×106细胞用冰PBS洗2次，调整细胞浓度为1×106/ml，加5μl Annexin V（1：10稀释）和5μl碘化丙锭（PI）（250μg/ml）于490μl细胞悬液中，放置冰浴10min，用流式细胞仪(型号COULTER EPICS-XL)分析细胞凋亡情况。
1.2.2 杀伤力检测 以MTT（四甲偶氮唑蓝）比色法检测As2S3对HL-60细胞的杀伤率。将生长良好的HL-60细胞以2×105/ml浓度加入96孔培养板，每孔100μl，加入不同浓度的As2S3，每一浓度设3个复孔，并设对照孔，置37℃、5%CO2条件下培养48h，加入MTT（5mg/ml）10μl/孔，继续孵育2h后，再加入DMSO　100μl/孔，打匀后酶标仪（型号Micro ReaderTM 4Plus）570nm处读吸光度A值。并利用对数几率图解法测定药物的半数抑制浓度（IC50）。
2 结果
2.1 As2S3对HL-60细胞增壮的抑制作用 经0.5μmol/L As2S3处理的HL-60细胞生长受到轻微抑制，经1μmol/L 、2μmol/L As2S3处理的HL-60细胞生长受到明显抑制（见图1），As2S3处理48h，对HL-60细胞的IC50为1.23μmol/L。
2.2 形态学变化 HL-60细胞经As2S3处理后，在透射电镜下可见典型的凋亡形态学特征：细胞固缩，胞浆浓缩，染色质聚集，核碎裂，有的形成凋亡小体（见图２），亦可见到坏死细胞(见图3)。在倒置显微镜下可见凋亡细胞体积缩小，胞膜完整，细胞折光度明显加深，坏死细胞膜破裂，活细胞则细胞透亮、折光度好。