医药学论文：高迁移率族蛋白B1及其生物学效应研究进展

［摘要］ 高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）是一种高度保守的核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞。随着其晚期促炎作用的发现，HMGB1成为近年来危重医学研究的热点之一。本文就其家族分类、基因和蛋白结构、细胞生物学效应方究进展进行综述。
［关键词］ 高迁移率族蛋白B1；生物学效应
脓毒症(sepsis)指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是严重创伤、烧伤、休克、感染、大手术后常见的并发症。早期的研究认为，肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1(IL-1)等在脓毒症炎性反应中发挥重要促炎作用。然而，TNF-α、IL-1拮抗剂的临床应用并未取得明显效果。原因可能是多方面的，其中重要的一点可能与脓毒症初期致炎介质迅速释放，临床治疗难以做到早期或预防性干预有关。另有资料证实［1］，以致死剂量的内毒素攻击小鼠，部分动物5天后才死亡，而此时TNF-α、IL-1的水平早已恢复至正常范围。此外，给TNF缺陷小鼠注入内毒素数天后亦可导致死亡。这提示可能还存在TNF-α等早期致炎因子以外的其他重要细胞因子参与介导内毒素致死效应。Wang等［1］发现LPS刺激16 h，TNF等早期炎性因子释放高峰过后，巨噬细胞开始释放出一种核蛋白，即高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)。HMGB1抗体治疗可显著降低LPS小鼠死亡率，表明HMGB1是内毒素致死效应的晚期重要炎症介质。这一发现为从本质上了解和防治脓毒症提供新的理论根据。
1 高迁移率族蛋白家族
事实上，早在20世纪60年代高迁移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)已由Johns发现，并于1973年首次在牛胸腺中被提取和鉴定，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名。根据分子质量大小、序列相似性和DNA结构特性，HMG可进一步分为HMGA、HMGB、HMGN 3个家族［2］。而HMGB家族又有3个成员，即HMGB1、HMGB2和HMGB3，三者在氨基酸序列上有80%的一致性。HMGB1是含量最丰富的HMG蛋白，在典型的哺乳动物细胞内约有106个分子，平均10～15个核小体即可含有1个HMGB1分子。HMGB1广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中，HMGB1除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外，在大多数组织中存在于胞核［3］；而HMGB2/3分布较局限，HMGB2仅分布在睾丸和淋巴组织中，HMGB3仅在胚胎中被发现，二者可能与胚胎发育有关。HMGB1先前也称HMG1，在进化过程中其氨基酸序列高度保守，啮齿类动物与人的氨基酸序列同源性高达98%以上，小鼠与大鼠氨基酸序列同源性更是高达100%［4］。
2 HMGB1基因与蛋白质结构
（1）人类HMGB1基因位于13q12染色体上。HMGB1基因包括5个外显子和4个内含子［5］。HMGB1基因有十分强大的TATA盒启动子。它的最大活性是猴病毒40(SV 40)启动子的18倍。这个启动子还包括数个转录因子结合位点，如激活蛋白1(AP1)。此外还包含一个沉默元件(silencer element)，因此，在一般环境条件下，HMGB1的表达量维持在基础水平［6］。HMGB1基因敲除后幼鼠仍能存活，但存在广泛的形态畸形，多于出生24 h内死亡。(2)人类HMGB1的初级氨基酸序列中含有219个氨基酸残基，成熟HMGB1分子质量为30 ku。HMGB1蛋白由3个独特的结构域组成（图1）。其中A-box位于N-末端，进化高度保守；C-tail在羧基末端，包含30个重复的天冬氨酸和谷氨酸残基，可参与调节HMGB1与DNA结合的亲和力；B-box位于二者之间。A-box和B-box均由3个α螺旋组成，并带有强烈的正电荷，构成HMGB1的非特异性DNA结合区。HMGB1释放至胞外后，B-box是引起炎症反应的功能结构域，而A-box对B-box有一定的拮抗作用［7］。此外，人们把一个与A-box和B-box结构域同源，约含85个氨基酸的重复区命名为DNA结合基元，为区别起见，将DNA结合基元的蛋白称为HMG-box。HMG-box起源古老，其中包括序列特异性DNA结合蛋白和非特异性结合蛋白，系辨认和结合变形DNA所必需的结构［8］。HMGB1在不同的物种中高度保守，大鼠与小鼠的HMGB1蛋白序列完全一致，与人类HMGB1蛋白的不同点只是C末端重复序列中有2个残基被置换。

图1 HMGB1蛋白结构示意图

3 HMGB1的细胞生物效应
3.1 细胞骨架蛋白并参与转录调节 胞核中HMGB1的主要生物学功能是与DNA结合。当HMGB1被特异性结合蛋白募集至靶点时，可通过与DNA双链小槽的结合，促使双链局部变形，这可能是DNA三维结构形成的机制之一［9］。核内HMGB1与特定结构的染色质DNA如四臂DNA、十字形DNA、超螺旋DNA等结合，通过影响靶序列的结构，参与DNA的重组、修复、基因转录调控、细胞复制及分化成熟等生命活动。但在细胞有丝分裂期和细胞间期，HMGB1与DNA的结合都是松散的，它在核结合态与胞质溶解态之间的转变迅速［10］，HMGB1的这一特性在其致炎作用中有着十分特殊且重要的意义。
3.2 诱导炎性反应 近年的研究发现，HMGB1一旦分泌到细胞外，即可发挥致炎作用。现在认为，HMGB1是一种重要的晚期致炎因子，且较之TNF、IL-1等早期速发型炎性因子具有更重要的临床意义。
机械损伤和坏死的细胞可将核内HMGB1释放至细胞外诱导炎性反应。受损细胞与巨噬细胞联合培养可致巨噬细胞核转录因子-κB(NF-κB)核内转移，并产生类似组织坏死后引起的炎性反应；HMGB1基因剔除小鼠的受损细胞与巨噬细胞联合培养，则炎性反应的强度显著降低。这表明HMGB1的被动释放在组织坏死性炎性反应中有重要作用。凋亡细胞中组蛋白普遍乙酰化不足，所以凋亡细胞中HMGB1可与核小体紧密结合，不会被释放，也不会导致炎性反应；相反，如果抑制细胞内的脱乙酰作用，炎性反应就会发生［11］。
内毒素及多种炎性因子均可诱导HMGB1释放介导炎性反应。1999年Wang等［1］首次报道HMGB1作为一种晚期炎性介质参与了脓毒症的发病过程。小鼠实验证实，注射LPS、IL-1、TNF-α 8 h后，单核巨噬细胞开始分泌HMGB1，并在随后的24 h中血清HMGB1浓度维持较高水平，HMGB1抗体可以改善LPS引起的内毒素血症；反过来，HMGB1也可刺激单核巨噬细胞分泌某些促炎因子，如TNF-α、IL-1、II-6、IL-8，但不包括IL-10和IL-12［11］。与LPS相比，HMGB1引起的TNF-α分泌曲线呈明显的双峰型，峰值分别出现在3 h和8～10 h［11］，其意义对于延长和维持炎性反应起重要作用。注射HMGB1小鼠出现内毒素休克样症状。人体检测也发现，脓毒症患者血清HMGB1水平升高，并且升高的程度与感染严重性相关。
作为联系免疫和神经内分泌系统的垂体后叶细胞也可对TNF-α、IL-1的刺激产生应答进而释放HMGB1，这表明HMGB1参与了炎症过程中的神经-内分泌免疫调节机制［1］。系列实验研究认为，HMGB1在中枢神经系统中可起到一种内生性致热源的作用，并且介导了中枢的炎性反应［11］。
当细胞坏死或受损时，核内的HMGB1可释放到胞外，引发单核巨噬细胞分泌促炎因子；而促炎因子又反过来促进HMGB1的分泌，这样正反馈环就形成了。在炎性反应的后期，这种正反馈效应对炎性反应的维持到了相当重要的作用。
3.3 参与肿瘤细胞生殖分化和迁移 HMGB1是目前唯一知道的与肿瘤和新生物形成有关的HMB家族成员。有学者从分化良好的人胃癌细胞中分离出一种HMGB1 cDNA克隆。研究还发现胃肠癌组织中，HMGB1 mRNA比毗邻分化好的癌变组织和癌前病变组织表达要高。在晚期癌肿和分化差甚至中等分化癌周围的非癌组织中，HMGB1 mRNA的表达也增强，但在分化较好的胃癌周围的正常组织表达并不增高［12］。这提示HMGB1可能与细胞分化有关。
胞外的HMGB1可以促进细胞的迁移，这一点在肿瘤细胞的入侵和转移过程中似乎尤为重要。将Lewis肺癌细胞注射于小鼠皮下，给予HMGB1抗体可以抑制肿瘤细胞的转移［13］。这一过程可能经HMGB1-RAGE (receptor for advanced glycation endproducts)信号通路介导。
3.4 促进神经细胞的生长 从小鼠大脑提取纯化的膜结合HMGB1具有调节轴突外向生长的活性［14］，提示它能够增强大脑神经元发育和外周神经元再生。HMGB1在神经元细胞体和轴突上含量都很丰富，位于神经元和外周胶质细胞的非细胞核细胞器上。而在大鼠神经元培养液中，抗HMGB1抗体可显著抑制轴突生长。这说明HMGB1在神经生长发育过程中起着非常重要的作用。
3.5 影响凝血、纤溶系统功能 HMGB1可影响机体的凝血功能。业已明确，HMGB1是一种强有力的肝素结合蛋白，可诱导内皮细胞释放纤溶蛋白酶原激活因子抑制物和组织型纤溶蛋白酶原激活物，还能间接促进细胞表面纤溶酶原的产生［15］。赖氨酸类似物ε-氨基乙酸则抑制HMGB1与纤溶酶原及其组织型纤溶蛋白酶原激活剂结合，提示该效应是通过与赖氨酸残基发生作用而实现的。胞外HMGB1能使纤溶酶原与组织型纤溶酶原激活物(t-PA)结合，促进纤维蛋白溶酶的产生，从而在细胞受损和组织重建中起重要作用。HMGB1还能够活化金属蛋白激酶MMP-2和MMP-9，它们是纤溶酶活化反应的下游靶分子。作为血小板内源性蛋白，人血小板活化时胞浆中的HMGB1被分泌至血小板表面，可引起血小板变形。提示脓毒症时，HMGB1对凝血纤溶活性以及血小板功能的影响可促发弥散性血管内凝血(DIC)，导致微循环障碍。
3.6 对血管内皮细胞功能的影响 血管内皮细胞是一种多功能细胞，除物质转运屏障、抗血栓、促血栓作用外，还可与白细胞相互作用参与炎症的调控。实验显示［16］，重组人HMGB1与微血管内皮细胞共同孵孕，HMGB1能以时间剂量依赖方式增加ICAM-1、VCAM-1和RAGE的表达；促使TNF、MCP-1、IL-8、PAI-1和t-PA分泌；使得MAP激酶、ERK激酶、JNK激酶磷酸化，并使核转录因子NF-κB和Sp1发生核移位。提示HMGB1在脓毒症和内毒素休克时能影响血管内皮细胞的正常功能。
3.7 对免疫系统功能的影响 免疫功能紊乱贯穿于脓毒症的整个病理过程，由早期的促炎介质增加向抗炎免疫抑制状态转变，乃至终末期的免疫无反应。研究证实，可能与感染后期机体细胞免疫功能紊乱有关［15］。作为细胞核内非组蛋白的HMGB1：（1）时间-剂量依赖性影响离体培养小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。（2）高剂量HMGB1攻击可使小鼠脾淋巴细胞增殖反应明显抑制，凋亡增加。同时，动物IL-2产生减少，IL-2/可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)比值下降。不同浓度的HMGB1能够影响淋巴细胞增殖功能，并且在不同淋巴器官中发挥的效应明显不同。（3）烫伤后大量产生的HMGB1可能参与了全身和肠道局部免疫功能障碍的病理过程。休克期切痂能够减少烫伤大鼠HMGB1基因表达与蛋白释放，促进全身和肠道局部免疫功能恢复，肝、肺组织促炎/抗炎平衡及脏器功能指标得以改善。（4）丙酮酸乙酯可通过抑制HMGB1的释放及拮抗氧自由基等多方面效应减轻淋巴细胞的功能异常，即显著增加脾淋巴细胞增殖能力和IL-2产生，从而有效改善烫伤延迟复苏后细胞免疫功能障碍。