医药学论文：疟疾核酸免疫的研究进展

联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织联合倡建的热带病特别规划防治的6种主要热带病中，除麻风病外，其余5种都是寄生虫病，而疟疾则是危害性最大的一类寄生虫病。尽管全国世界以蚊媒控制和药物治疗为中心的大规模防治计划开展了近40年，但目前仍有100个国家和地区不同程度地受到疾疾的威胁。由于环境改变和流动人口的增加，受威胁人口很大的可变性。据估计，1994年有23亿人口(占世界人口的41％)居住在受疟疾威胁的地区。估计全世界疟疾发病每年3－年亿例，死亡人数为150－270万人。大约100万例5岁以下儿童死亡是由疟疾或同时伴有其它疾病所致[1]，因而疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。

　　疟原虫生活史有多个时期，每个生活史期有多种抗原，而且每种抗原具有多个表位，有些抗原还有多个等位基因，相同抗原又有多种结构形式，免疫系统有多种作用因子，而不同宿主的免疫反应也不相同，所有的这些因素给疟疾疫苗的研制带来了许多困难[2]。从现有的疟疾疫苗看，疟疾的第一代疫苗--全虫减毒疫苗激发的免疫反应低下，临床试验效果不佳。即使是寄予厚望的第二代疫苗--基因工程亚单位疫苗和化学合成多肽疫苗，也由于表达产物翻译后的修饰功能较差难以确保抗原的天然构型及免疫原性，特别是对保护性抗原多为糖蛋白的虫体生活史时期来说更是难以达到免疫保护效果，同时表达产物的纯化过程也极为复杂，给实际应用带来了困难。因此，近年兴起的核酸免疫为疟疾疫苗的研制带来了希望。核酸疫苗被看作是极具发展潜力的第三代疫苗[3]。核酸免疫已成为预防和治疗传染病的一种有希望的基因治疗方法，带有病原体抗原基因的质粒DNA直接导入宿主细胞，可激发出针对编码抗原的特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答[4]。在短短的几年中核酸免疫已取得了长足的进展，本文就核酸免疫在疟疾疫苗研制中的应用作一综述。

　　1　鼠约氏疟原虫的DNA疫苗

　　1.1　环子孢子DNA疫苗

　　约氏疟原虫(P,yoelii)环子孢子蛋白(CSP，391aa)(简称为PyCSP)是子孢子表面表达最多的一种抗原，它也可表达于红外期寄生虫的质膜和纳虫泡膜上。PyCSP是保护性免疫应答的靶抗原，过继转移PyCSP特异的CD8+和CD4+T细胞可保护小鼠的子孢子攻击感染。而在体外，PyCSP特异的CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)可以MHC-限制方式消灭培养感染肝细胞，而且针对PyCSP高度显位重复区的抗体可在体外抑制子孢子的侵入，并可被动传递免疫保护作用给未受感染的小鼠[5]。

　　Sedegah等[6]将重新构建的含有PyCSP基因的质粒DNA直接肌肉注射免疫小鼠，并与辐射减毒子孢子的免疫效果相比较。结果发现，核酸免疫小鼠可发产生抗CSP的特异性抗体和CTL反应，它们的反应水平均高于减毒子孢子免疫的小鼠。核酸免疫小鼠用5×105子孢子进行攻击感染，结果肝期寄生虫的负荷可减少86％；而以102子孢子攻击感染经过2－3次核酸免疫的动物，发现核酸疫苗对68％(18/28)的小鼠具有保护作用，并且这种保护作用依赖D8+T细胞。尽管PyCSP质粒DNA免疫BALB/c小鼠可以剂量依赖形式诱导出高水平的CSP特异性抗体，且比减毒子孢子免疫鼠抗体水平高10－15倍，然而通过体外检测抗体对子孢子侵入肝期的寄生虫生长发育的抑制作用，发现该DNA疫苗诱导的抗体应答只有中等水平的生物学活性。提示，上述DNAU疫苗的保护作用主要依赖于CTL介导的免疫应答。说明核酸免疫可用于抗疟原虫感染。PyCSP质粒DNA免疫可诱导针对PyCSP的一种已被鉴定但尚未命名的CTL抗原特异性表位、MHC限制的CD8+CTL，且CTL应答与抗体应答呈相关关系。PyCSP dNA免疫诱导的CTL的水平(70％－80％特异性溶解靶细胞)明显高于射线减毒子孢子(20％－30％特异性溶解靶细胞)免疫诱导的保护性免疫水平。Hoffman等[7]同样构建了可编码PyCSP基因的重组质粒进行动物免疫试验，获得了与Sedegah等[8]报道相似的免疫效果。同时他们还发现，免疫注射3次(20-40μg/次)质粒DNA可达到与每次注射200μg相同的保护性免疫效应，而且延长免疫间隔期似处可增强免疫效应。

　　许多研究表明，MHC和非MHC基因可调控小鼠对约氏疟原虫感染的保护作用，而且针对恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、约氏疟原虫及伯氏疟原虫(P.berghei)的CD8+和CD4+T细胞表位和B细胞表位的免疫应答均受遗传基因的限制。因此，为考察DNA疫苗在P.yoelii鼠模型中的保护效果，Doolan等[8]利用能编码PyCSP的质粒DNA免疫5株近交系小鼠，它们的遗传背景和H-2单倍型分别为BALB/c(H-2d)、A/J(H-2a)、B10.BR(H-2k)、B10.Q(H-2q)及C57BL/c(H-2b)。同时还免疫了另一株远交系小鼠CD-1。结果只有BALB/c(H-2d)小鼠获得高效免疫，其抵抗攻击感染的保护率为75％。

　　1.2　肝细胞红细胞蛋白DNA疫苗

　　用单克降抗体NYLS3(NYLS3-McAb)在约氏疟原虫感染的肝细胞和红细胞的纳虫泡膜上可鉴定出一种17kDa的蛋白抗原，这种抗原被命名为肝细胞红细胞蛋白(PyHEP17)，它也是保护性免疫应答的靶抗原[9]。NYLS3-McAb可以特异地消灭培养的肝期寄生虫。在体内，被动转移NYLS3-McAb给未感染动物，可以降低原虫血症的虫体数量。Doolan等[8]用肝内及无性血液期均表达PyHEP17的cDNA构建的质粒DNA作为疫免疫小鼠，结果可保护5株近交系中的3株，其单倍型及保护率分别为H-2a，71％；H-2k，54％；H-2d，26％，而且B10.BR小鼠(H-2a)则仅有17％的保护率，C57BL/c(H-2b)则不能保护攻击感染。远交系小鼠CD-1则表现出40％－50％的保护率。但PyHEP17质粒DNA免疫并不能保护小鼠对血液期疟原虫的攻击感染。核酸免疫可在BALB/c小鼠中诱导出抗原特异、MHC限制的CD8+CTL，而A/J或B10.BR则检测不到CTL。与PyCSP质粒DNA免疫不同的是，PyHEP17质粒DNA免疫鼠诱导的CTL与抗体产量并不呈相关关系，因为在所有的5株小鼠中几乎检测不到抗体的产生。

　　1.3　核酸疫苗的基因调控

　　上述研究结果表明，PyCSP或PyHEP17质粒DNA免疫诱导的保护性免疫作用受基因调控，且早期的研究证明免疫应答也受基因调控。提示，针对疟疾的单一效价疫苗无法保护遗传背景复杂的远交系动物和人类；即使在近交系小鼠中，PyCSP和PyHEP17质粒DNA的免疫效果也表现出遗传限制的不同保护模式。Doolan等[8]试用上述两种质粒DNA(PyCSP和PyHEP17)的混合物免疫接种，以确定这种遗传限制的免疫保护模式是否可被二价DNA疫苗所阻断。结果发现，在B10.BR小鼠中，单价PyCSP或PyHEP17质粒DNA免疫后的保护分别为8％和54％，而两者的混合物同时免疫则可诱导85％的保护率，在BALB/c和A/J两株小鼠中，经二价疫苗免疫后也表现出明显升高的保护率(80％－90％)，则另外两株小鼠则未能完全保护，从而导致了疟原虫血症的发生，但其出现时间与对照组相比推迟了4天，与其90％的感染肝细胞被消灭相一致。因此，二价DNA疫苗可保护不同遗传背景和H-2单倍型的小鼠，并在B10.BR小鼠中，这种保护作用呈现叠加效应。这些结果提示，小鼠对核酸疫苗诱发的免疫应答受基因调控，单一效价的疫苗似乎很难对不同遗传背景的个体提供完全的保护作用，而二价的DNA疫苗则可以保护不同遗传背景及H-2单倍型的小鼠，同样也只有二价或多价的核酸疫苗方可保护遗传背景更复杂的人类。同时本试验结果还表明，可用与PyHEP17同源的恶性疟原虫基因构建质粒DNA以进行人体恶性疟原虫的免疫研究。