医药学论文：我国弓形虫病核酸疫苗研究概况

关键词：弓形虫病
Status in the research of nucleic acid vaccine against toxoplasma in China.
刚地弓形虫（简称弓形虫）呈世界性分布，哺乳动物及鸟类普遍易感。人类对弓形虫有较强的自然免疫力，感染后绝大多数无明显症状表现，或只出现亚急性弓形虫病。但在孕妇及免疫功能低下者（如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等）感染弓形虫后引起的危害严重。人体弓形虫感染日益受到关注，弓形虫病疫苗成为当前研究的热点。动物实验发现，弓形虫全虫疫苗，弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染度作用，但前者可能会引起再感染，后者的免疫保护效果较差。弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足，具有良好的开发应用前景。我国从上世纪90年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制，通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组，先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗。动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果。
1 保护性抗原及目的基因研究
弓形虫裂殖了表面膜蛋白（SAG） ［1，2］ ，致密颗粒蛋白（GRA） ［3］ 和棒状体蛋白（ROP） ［4］ 是重要的弓形虫抗原，这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关，且能诱导宿主的免疫反应。


1.1.3 P35 研究发现，P35蛋白的C端区（201～225及301～340号氨基酸）具有高亲水性，利用蛋白质分析软件分析P35基因编码的氨基酸序列，发现其编码的氨基酸序列含有多个T、B淋巴细胞表位，证明P35蛋白具有抗原性。林敏等 ［11］ 采用RT-PCR技术从弓形虫cDNA文库中扩增出编码P35抗原的基因片段，构建了弓形虫RH株表面抗原P35基因重组表达质粒P35/pGEX-21，并在大肠杆菌JMl09中成功表达了分子质量为70kDa融合蛋白，该蛋白能为谷胱甘肽S转移酶（GST）单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。
1.1.4 P23 与其它弓形虫表面腆蛋白不同，P23不是GPI锚定蛋白，P23的N端连接有糖基化位点，是慢性弓形虫病的一个分子标志。疫苗研究发现，24kDa的多肽物质能诱导产生一定的免疫保护力。用24kDa多肽免疫动物后，在该动物血液中检测到了抗P23抗体 ［12］ 。闪此认为P23可能包含该多肽的免疫表位，其基因序列可能存在同源性。是有希望的弓形虫病疫苗候选基冈。
1.2 GRA 弓形虫致密颗粒秆放多种蛋白（GRA），已经报道的有8种，其中研究较多的有GRAl、GRA4、GRA6手GRA8。
1.2.1 GRAl GRAl是慢性弓形虫病的标志性抗原分子。研究表明，GRAl可诱导免疫动物产生以IFN-R升高为特征的保护性细胞免疫应答。彭碧云等 ［13］ 将构建的GRAl基因重组质粒用脂质体介导，转染到小鼠巨噬细胞RAW264.7，光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线。结果证明重组质粒的表达产物使巨噬细胞增殖能力增强。贾雪梅等 ［14］ 利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRAl基因片段，成功构建了pEGFP-N3-GRAl真核表达重组质粒。
1.2.2 GRA4 GRA4蛋白分子质量为40kDa，存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡中，当速殖子分裂并侵入细胞时GRA4被分泌到细胞外，刺激机体免疫系统产生粘膜免疫及全身免疫。林绮萍等 ［15］ 根据GRA4基因序列，设计并合成PCR引物，扩增弓形虫GRA4基因片段，成功构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-GRA4，该重组子在大肠杆菌中经IPTG诱导，表达分子质量为60.3kDa的融合蛋白，该蛋白能与免抗弓形虫血清发生反应。
1.2.3 GRA6 GRA6分子存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡，与裂殖子的入侵有关。朱翔等 ［16］ 采用聚合酶链反应从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，导入表达载体PGEX-5X-3，然后在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RP中进行表达。经SDS-PAGE鉴定表达产物分子质量为49kDa，能被感染弓形虫者特异性IgM和IgG血清所识别。